芝麻素對C57BL/6小鼠Lewis肺癌的抑制作用及其機(jī)制

楊 慧，楊解人，唐麗娟，張俊秀，李文星，王宏婷，陳國祥

(皖南醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

Ses為芝麻籽中的木酚素類成分，具有抗高血壓、保護(hù)肝臟、抗氧化、抑制癌細(xì)胞、調(diào)節(jié)免疫功能、降低膽固醇等作用［1］。日本東京大學(xué)醫(yī)學(xué)院首次研究證實(shí)Ses具有抗癌功效，對肝癌、皮膚癌有抑制作用，認(rèn)為低濃度的Ses飲食可能作為肝癌形成的抑制劑［2］。國內(nèi)文獻(xiàn)報道Ses對S180荷瘤小鼠有顯著的抑瘤作用，其機(jī)制可能與促進(jìn)宿主免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)有關(guān)［3］;Ses有明顯抑制肝癌H22細(xì)胞增殖的作用［4］，但對Lewis的研究未見報道。因此本研究采用體內(nèi)和體外血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，觀察Ses對C57BL/6小鼠Lewis肺癌的抑瘤作用，旨在進(jìn)一步闡明Ses的抗腫瘤作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動物 雌性C57BL/6小鼠40只，體重(20±2)g，合格證號:SCXK20070001(購自南京青龍山實(shí)驗(yàn)動物中心)。普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，室溫(22～24)℃。

1.2 藥物與試劑 Ses，分子式:C20H18O6，分子量:354.36，純度＞94%，由蕪湖天一綠寶科技有限公司提供，批號:04312;5-Fu:50 mg/片，100 片/瓶，批號:H37021326(齊魯制藥有限公司)。SABC免疫組化試劑盒(SA1022)，購自武漢博士德生物工程有限公司;MMP-2一抗(ZA-0331)、MMP-9一抗(ZA-0336)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DMEM高糖培基(Hyclone公司)、優(yōu)級胎牛血清(杭州四季青公司)、MTT(Amresco)。

1.3 儀器 CO2水套培養(yǎng)箱(Forma Scientific)、CBV-1500A高性能超凈工作臺(上海瑞仰凈化裝備公司)、酶標(biāo)儀(DTX880 Multimode Detector，Beckman Coulter)、高速冷凍離心機(jī)(Heraeus)、-80℃冰箱(Forma Scientific)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 將Lewis肺腺癌細(xì)胞株(LLC，為C57BL/6小鼠源性肺腺癌細(xì)胞，上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫提供)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%～90%密度時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2傳代。

1.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

1.5.1 模型建立、分組及給藥 將對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞(5×106/ml)，按0.2 ml/只分別接種于40只雌性C57BL/6小鼠右前肢腋部皮下，復(fù)制小鼠Lewis肺癌模型。10日后待肉眼可見右腋部腫塊視為造模成功。將成模小鼠40只，隨機(jī)分為模型組［0.5%羧甲基纖維素10 ml/(kg·d)］、Ses低、中、高劑量組［30、60、120 mg/(kg·d)］和陽性對照組［5-Fu 128 mg/(kg·d)］，共5 組，每組8 只。Ses用0.5%羧甲基纖維素制成混懸液，5-Fu溶于蒸餾水中，于每日上午9時灌胃給藥［10 ml/(kg·d)］1次，連續(xù)給藥28 d。

1.5.2 監(jiān)測瘤體積、繪制腫瘤增殖曲線 稱每日進(jìn)食量及每周小鼠體重，每隔3 d用游標(biāo)卡尺測腫瘤長、短徑1次，并計算瘤體積，瘤體積=0.5ab2(a長徑，b短徑)，根據(jù)瘤體積經(jīng)時變化繪制腫瘤增殖曲線。

1.5.3 計算腫瘤抑制率及臟器系數(shù) 末次給藥后稱重并處死小鼠，完整剝離腫瘤稱瘤重，稱脾、胸腺濕重，計算腫瘤抑制率和臟器系數(shù)。

1.5.4 觀察瘤組織病理學(xué)改變 剝?nèi)×鼋M織，用10%甲醛固定24 h，常規(guī)石臘包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察瘤組織病理學(xué)改變。

1.5.5 免疫組化法表達(dá)MMP-2、MMP-9 將腫瘤組織常規(guī)病理取材，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，染色程序嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片觀察。結(jié)果判斷:MMP-2、MMP-9陽性表達(dá)均為腫瘤細(xì)胞胞膜或胞質(zhì)呈棕黃色。所有染色切片在同一條件下采用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析，每張切片隨機(jī)選取5個完整而不重疊的高倍鏡視野(400×)，測定每個視野下陽性反應(yīng)的平均灰度值。陽性表達(dá)水平應(yīng)用平均灰度值(±s)表示，最黑像素的灰度值為0，最白像素的灰度值為255，灰度值愈小其陽性表達(dá)水平愈高，反之則表達(dá)水平愈低。

1.5.6 ELISA法檢測TNF-α水平 瘤組織勻漿、離心后，取其上清液，于96孔包被板中設(shè)置6個標(biāo)準(zhǔn)品孔，并設(shè)置空白對照孔和樣本孔。嚴(yán)格按照試劑盒步驟進(jìn)行，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處OD值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線查找待測樣品TNF-α水平。

1.6 體外實(shí)驗(yàn)

1.6.1 含藥血清的制備 運(yùn)用血清藥理學(xué)方法，收集動物含藥血清。取Wistar大鼠20只，根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果隨機(jī)分成兩組，即 Ses組［160 mg/(kg·d)］、空白對照組［生理鹽水10 m l/(kg·d)］，每組10只，連續(xù)灌胃給藥14 d，于末次給藥后2 h，腹主動脈取血，離心管中靜置1 h，4℃、3 000 r/min離心10 min，無菌分離血清后，56℃恒溫滅活30 min，于0.22μm微孔濾膜過濾除菌，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 Ses含藥血清組培養(yǎng)液制備 見表1。

表1 各組含藥血清培養(yǎng)液配置Tab1 Solution preparation of the serum containing Ses in each group

1.6.3 MTT法檢測細(xì)胞抑瘤率 取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細(xì)胞，用含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105/ml～5×105/ml，加入96孔培養(yǎng)板，每孔200μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜，待細(xì)胞貼壁約70%～80%時，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，分別加入 Ses 10%、20%、40%、60%、80%、100%含藥血清各20μl，陰性對照組加入含生理鹽水血清 20μl，每組設(shè)5個復(fù)孔，每孔終體積為200μl，不足部分加入含10%FBS的 DMEM培養(yǎng)液。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育48 h后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去各孔中的上清液，每孔再加入DMSO 200μl，置搖床上低速振蕩10～15 min，在492 nm處測定OD值，計算抑瘤率。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 Ses對腫瘤增殖曲線的影響及對腫瘤體積經(jīng)時變化影響 根據(jù)不同時期各組體積均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差繪制腫瘤增殖曲線(圖1)。從接種第14天開始，Lewis肺癌細(xì)胞進(jìn)入快速增殖期。由圖1可見，5-Fu組腫瘤細(xì)胞增殖受到明顯抑制(P＜0.05)，Ses低、中、高劑量組也有一定的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的趨勢，但作用不明顯(P＞0.05)。接種后第38天小鼠腫瘤生長體積，與模型組相比，5-Fu組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，Ses低、中、高劑量組雖無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，但隨著劑量的加大，腫瘤體積有減小趨勢;與5-Fu組相比，Ses低、中、高劑量組無差異(P＞0.05)。提示Ses具有輕度的抑制小鼠腫瘤體積生長的作用。

圖1 腫瘤增殖曲線Fig1 The curve for tumor proliferation

2.1.2 Ses對瘤重及腫瘤抑制率的影響 與模型組相比，小鼠給藥28 d后，Ses低、中、高劑量組雖無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但瘤重隨著劑量的增加呈逐漸遞減趨勢，5-Fu組瘤重明顯減輕，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);Ses低、中、高劑量組腫瘤抑制率分別為11.16%、15.14%、18.66%。提示 Ses具有一定的減輕瘤重的作用(圖2)。

圖2 Ses對小鼠瘤重的影響Fig2 Effects of Ses on the weight of tumors

2.1.3 Ses對脾臟及胸腺臟器系數(shù)的影響 由圖3、4可見，模型組脾臟系數(shù)較高，考慮可能與腫瘤的刺激引起反應(yīng)性增生有關(guān)［5］。與模型組相比，Ses低劑量組、5-Fu組小鼠的脾臟系數(shù)明顯降低，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，Ses中、高劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);與陽性組相比，Ses低、中、高劑量組脾臟系數(shù)明顯升高(P＜0.01或P＜0.05)，并且隨著Ses劑量的增加，脾臟系數(shù)逐漸升高。模型組胸腺系數(shù)較低，可能與腫瘤產(chǎn)生的某種活性因子導(dǎo)致胸腺縮小有關(guān)［6］。與模型組相比，Ses低、中、高劑量組胸腺系數(shù)均有所升高，其中Ses高劑量組升高最為明顯(P＜0.05)，5-Fu組胸腺系數(shù)無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示Ses有免疫增強(qiáng)作用，而5-Fu有免疫抑制作用。

圖3 Ses對小鼠脾臟臟器系數(shù)的影響Fig3 Effects of Ses on spleen coefficient

圖4 Ses對小鼠胸腺臟器系數(shù)的影響Fig4 Effects of Ses on thymus coefficient

2.1.4 Ses對腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化 模型組瘤體切面呈魚肉狀，易出血，與周圍組織粘連緊密不易剝離，光鏡下可見腫瘤細(xì)胞排列緊密，核大深染，核分裂像多見。Ses組腫瘤組織呈圓形或橢圓形，包膜大部分完整，表面光滑，血管較少，切面呈灰白與暗紅相間，瘤體與周圍組織較易剝離，光鏡下可見Ses高劑量組瘤細(xì)胞排列較稀疏，小片狀壞死區(qū)，有核固縮、溶解的現(xiàn)象。Ses中、低劑量組瘤細(xì)胞排列較松散，但壞死細(xì)胞較少;5-FU組瘤細(xì)胞生長不良，可見大片狀完全性壞死，血管稀少，可見腫瘤異型性及淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞的浸潤(圖5)。

2.1.5 Ses對腫瘤組織中MMP-2、MMP-9表達(dá)的影響 免疫組化圖像分析顯示，MMP2、MMP9主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒。與模型組相比，Ses高劑量組MMP-2、MMP-9灰度值表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，Ses低、中劑量組灰度值表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但有逐漸升高趨勢，表明陽性表達(dá)量是逐漸降低;與5-Fu組相比，Ses低、中劑量組MMP-2、MMP-9灰度值有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，而Ses高劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示Ses具有一定的劑量依賴性降低腫瘤組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)(見圖6～9)。

2.1.6 Ses對瘤組織中TNF-α含量的影響 與模型組相比，5-Fu組瘤組織中TNF-α含量降低，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);Ses低、中、高劑量組TNF-α表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但隨著劑量的增加，瘤組織TNF-α含量呈逐漸遞減趨勢(圖10)。

2.2 體外實(shí)驗(yàn)Ses含藥血清對Lewis肺癌細(xì)胞增殖的影響 與陰性血清對照組相比，Ses含藥血清80%、100%組OD值均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01或P＜0.05)，提示Ses含藥血清呈濃度依賴性抑制Lewis肺癌細(xì)胞的生長，濃度越高，抑制率越高，Ses含藥血清100%組增殖抑制率達(dá)到37.08%。表明Ses在體外對Lewis肺癌細(xì)胞有一定的抑制作用(圖11、12)。

3 討論

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明40只小鼠皮下接種Lewis肺癌細(xì)胞后第10日成瘤率達(dá)100%，同時外觀小鼠整體狀況較差，進(jìn)食量和活動量均減少，皮毛無光澤，豎毛現(xiàn)象明顯，腫瘤體積較大，14 d時增殖速度加快，脾臟系數(shù)較高，胸腺系數(shù)較低，瘤體切面呈魚肉狀，易出血，與周圍組織粘連緊密不易剝離，光鏡下可見腫瘤細(xì)胞排列緊密，核大深染，核分裂像多見，其結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致［7］，表明造模成功。

模型小鼠經(jīng)5-Fu治療后，發(fā)現(xiàn)小鼠腫瘤體積和增殖速度明顯減慢，抑瘤率達(dá)69.34%;瘤細(xì)胞生長不良，大片狀完全性壞死，血管稀少，可見腫瘤異型性及淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞的浸潤，說明5-Fu具有明顯抗腫瘤作用。但隨著給藥時間的延長，動物消瘦加劇，進(jìn)食量減少，皮毛缺乏光澤，伴有豎毛等現(xiàn)象，部分動物毛發(fā)脫落現(xiàn)象嚴(yán)重，甚至毛發(fā)變白，并出現(xiàn)胸腺萎縮，提示5-Fu在發(fā)揮抗腫瘤作用同時，具有免疫抑制和嚴(yán)重毒性作用。

與模型組相比，Ses組小鼠腫瘤生長體積、增長速度及抑瘤率療效較弱。該結(jié)果與文獻(xiàn)報道小劑量Ses對肝癌、皮膚癌、S180荷瘤小鼠及肝癌H22細(xì)胞有顯著的抑制作用［2～4］不完全一致，分析其原因可能與Ses對Lewis肺癌細(xì)胞敏感性較低，或與Ses的劑量偏小或療程偏短有關(guān)，值得進(jìn)一步研究和探討。

本研究新發(fā)現(xiàn)，隨著劑量增加，Ses組小鼠腫瘤組織呈圓形或橢圓形，包膜大部分完整，表面光滑，血管較少，切面呈灰白與暗紅相間，瘤體與周圍組織較易剝離，光鏡下可見瘤細(xì)胞排列較稀疏，小片狀壞死區(qū)，有核固縮、溶解的現(xiàn)象。尤其在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，Ses組小鼠進(jìn)食正常、活動自如、毛順光滑有光澤，無脫毛、體重減輕等現(xiàn)象，而且小鼠脾臟系數(shù)、胸腺系數(shù)逐漸升高，提示Ses在發(fā)揮抗腫瘤作用同時，不僅毒性低，而且具有免疫增強(qiáng)的作用。其免疫增強(qiáng)機(jī)制可能與Ses促進(jìn)宿主免疫功能、抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)有關(guān)［3］。

圖5 Ses對HE染色瘤組織的病理學(xué)影響(400×)Fig5 Effects of Ses on histol ogical specimens of tumor tissue(HE staining×400)

圖6 Ses對腫瘤組織中MMP-2灰度值的影響Fig6 Effects of Ses on gray scale of MMP-2 in tumor tissue

圖7 Ses對腫瘤組織中MMP-9灰度值的影響Fig7 Effect of Ses on gray scale of MMP-9 in tumor tissue

圖8 Ses對免疫組化表達(dá)腫瘤組織MMP-2含量的影響(400×)Fig8 Effect of Ses on content of MMP-2 in tumor tissue by immunohist ochemist r y(400×)

圖9 Ses對免疫組化表達(dá)腫瘤組織MMP-9含量的影響(400×)Fig9 Effect of Ses on content of MMP-9 in tumor tissue by immunohist ochemi st r y(400×)

腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中也起到關(guān)鍵作用。文獻(xiàn)報道，腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力與其產(chǎn)生或誘導(dǎo)產(chǎn)生的降ECM的蛋白酶密切相關(guān)［8］。在腫瘤的侵襲過程中，腫瘤細(xì)胞與ECM表面的整合素受體及各種非整合素受體結(jié)合，如層粘連蛋白，纖連蛋白等，結(jié)合后的腫瘤細(xì)胞直接分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)或誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生MMPs。MMPs是一類Zn2+依賴的細(xì)胞外蛋白水解酶，幾乎能降解ECM的所有成份，腫瘤細(xì)胞沿著降解破壞的ECM向周圍組織侵襲，導(dǎo)致腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移［9］。ECM和基底膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白是Ⅳ型膠原，而MMP-2和MMP-9是降解Ⅳ型膠原最主要的酶，故在肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中起著十分重要的作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠Lewis肺癌腫瘤組織中MMP-2及MMP-9呈高表達(dá)，而Ses高劑量組可明顯抑制小鼠Lewis肺癌腫瘤組織中MMP-2及MMP-9的表達(dá)，提示Ses抑制腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移可能與降低腫瘤組織中MMP-2及MMP-9的表達(dá)有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)5-Fu組瘤組織中TNF-α含量明顯低于模型組，而Ses各劑量組雖有下降趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義，其原因有待進(jìn)一步研究和證實(shí)。

圖10 Ses對瘤組織中TNF-α含量的影響Fig10 Effect of Ses on content of TNF-ɑin tumor tissue

圖11 Ses含藥血清對Lewis肺癌細(xì)胞增殖OD值的影響Fig11 Effects of serum containing Ses on value of OD in 2LL tumors

圖12 Ses含藥血清對Lewis肺癌細(xì)胞抑制率的影響Fig12 Effects of serum containing Ses on inhibition ratio of 3LL tumors

為了進(jìn)一步證實(shí)Ses的抗腫瘤作用，本研究采用血清藥理學(xué)方法，進(jìn)行體外MTT比色法測定，觀察對Lewis肺癌細(xì)胞株存活和生長情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ses含藥血清對Lewis肺癌細(xì)胞的存活和生長具有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性，該結(jié)果為Ses治療肺腺癌提供了一定的理論依據(jù)，但關(guān)于Ses確切抗肺腺癌的療效及機(jī)理有待于進(jìn)一步研究和探討。

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