山羊口瘡病毒的PCR診斷及防治

黃秀君

（四川省攀枝花市農(nóng)林科學(xué)研究院，攀枝花 617000）

四川省攀枝花市某羊場(chǎng)飼養(yǎng)山羊520只，2018年初產(chǎn)羔450只，羔羊出生10 d左右呈爆發(fā)性發(fā)病，發(fā)病率100%。發(fā)病羊只主要為羔羊，在患羊嘴角、口唇、鼻孔周圍及口腔黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和結(jié)成菜花狀增生物，有的羊只體溫升高、精神差、牙齦紅腫，口流涎、采食困難或者不采食，患羊逐漸消瘦，衰竭而死亡［1］。由于該場(chǎng)發(fā)病數(shù)量多、治療不及時(shí)，相繼有62只患羊死亡。通過臨床癥狀觀察，初步確診攀枝花某羊場(chǎng)羔羊疑似羊口瘡病毒感染，然后運(yùn)用半套式PCR方法對(duì)病料進(jìn)行診斷，確診病原并向該羊場(chǎng)提供可行的治療方案。

1 材料

1.1 病料

采集攀枝花某爆發(fā)疑似ORFV羊場(chǎng)病羊口唇部的痂皮6份。

1.2 主要試劑

動(dòng)物病毒DNA提取試劑盒，DNA Mark D2000，2×Power Taq PCR Master Mix、DNA純化回收試劑盒、pGMT載體、質(zhì)粒提取試劑盒，購自天根生物科技有限公司。

2 方法

2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)鄧宇［2］的文獻(xiàn)設(shè)計(jì)引物，上游引物ORF-P1：CGCAAGCCCGAGATGGTAA；下游引物 ORF-P2：CGAGCCCCATGAAGGAAAA；上游引物 ORF-P3：GATGAGGACGAACGGCTGGTA，提交上海捷瑞生物工程有限公司合成；參考該文獻(xiàn)的半套式PCR方法對(duì)待檢口唇部痂皮樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2.2 口瘡病毒DNA的提取

取ORFV XC13株細(xì)胞毒株疫苗毒株在-30℃反復(fù)凍融3次，12 000 r/min離心5 min；取上清備用。用生理鹽水清洗臨床組織病料，用滅菌剪刀剪碎后，放入組織勻漿機(jī)中充分勻漿，收集勻漿液-30℃反復(fù)凍融2次，12 000 r/min離心5 min，取上清置-30℃凍存?zhèn)溆?。取上清按?dòng)物病毒DNA提取試劑盒操作方法提取病毒DNA［2］。

2.3 羊口瘡病毒的PCR鑒定

根據(jù)鄧宇［2］的方法對(duì)6份DNA樣品進(jìn)行半套式PCR診斷。

2.4 PCR產(chǎn)物的純化測(cè)序與鑒定

將上述鑒定正確的PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，回收產(chǎn)物送上海捷瑞生物工程有限公司測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)。

3 結(jié)果與分析

采用半套式PCR對(duì)6份痂皮樣品進(jìn)行擴(kuò)增，均獲得大小為450 bp特異性擴(kuò)增片段，與預(yù)期擴(kuò)增DNA片段大小一致（圖1）?；厥?、純化、克隆、測(cè)序所獲得的DNA片段，測(cè)序結(jié)果經(jīng)GenBank中BLAST分析，與ORF毒株的同源性達(dá)98%以上，確診病原為山羊口瘡病毒。

圖1 半套式PCR檢測(cè)結(jié)果

4 治療

4.1 單一外嘴唇型感染治療

首先用生理鹽水浸泡的棉球軟化嘴唇結(jié)痂，然后用止血鉗剝?nèi)ヰ杵ぃ儆?%～5%的高錳酸鉀溶液清洗創(chuàng)面后涂擦5%碘酊，最后用冰硼散撒布瘡面，每天治療2次，待病變處開始長出新的組織后停止治療。

4.2 抗病毒，繼發(fā)感染治療

對(duì)體溫升高，牙齦、舌面紅腫，有潰瘍或化膿的患羊，首先清除口腔內(nèi)的壞死黏膜，然后用3%～5%的高錳酸鉀溶液沖洗干凈，再用冰硼散撒布瘡面；同時(shí)使用注射用頭孢噻呋鈉3 mg/kg和復(fù)方板蘭根注射液，0.2 mL/kg進(jìn)行肌肉注射，每天1次，連用7 d。

5 預(yù)防

（1）不從疫區(qū)引進(jìn)感染羊只。引進(jìn)羊只隔離觀察45 d無病方可合群飼養(yǎng)。在羊口瘡常發(fā)流行地區(qū)，用羊口瘡弱毒疫苗進(jìn)行免疫接種，每年1次［3-4］。

（2）增強(qiáng)懷孕母羊及產(chǎn)仔母羊的營養(yǎng)，飼喂多汁及柔軟的飼料，減少對(duì)口腔黏膜的損害，防止母羊口瘡病毒發(fā)生感染羔羊。

（3）羔羊出生后，在新生羔羊的口、鼻處和哺乳母羊乳房用高錳酸鉀溶液擦洗干凈，防止母羊乳頭和羔羊相互傳染，每3天消毒1次，消毒后注意不要立即讓羔羊吮乳［1］。

（4）保持圈舍及運(yùn)動(dòng)場(chǎng)清潔干燥。定期用2%氫氧化鈉溶液或者10%石灰乳對(duì)羊舍、用具及周圍環(huán)境消毒［4］。