成纖維細胞在皮膚損傷修復中的研究

曲廣男，馮穎，姜爽，孫悅

摘要：目的：研究成纖維細胞在皮膚損傷修復中的作用。方法： 建立大鼠背部皮膚損傷的動物模型，將新生乳鼠的成纖維細胞懸液注射入受損部位，分別于傷后不同時間觀察大鼠背部創(chuàng)面的外觀變化及其愈合情況，用創(chuàng)面肉芽組織制作冰凍切片，以損傷皮膚的恢復情況來評價修復效果。結果：注射了成纖維細胞的大鼠，與未注射成纖維細胞的大鼠相比損傷修復的速度明顯變快，愈合指數(shù)較高。結論：成纖維細胞對組織缺損的修復有促進作用。

關鍵詞：成纖維細胞；細胞培養(yǎng)；皮膚損傷；創(chuàng)面愈合

項目基金：通化師范學院大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201710202033）；通化師范學院實驗室開放基金

中圖分類號：L929 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.18.022

成纖維細胞具有分布廣泛、取材方便、對機體損傷較小、體外培養(yǎng)容易成活、增殖較快等優(yōu)點，可進行一般創(chuàng)傷修復和骨創(chuàng)傷修復。皮膚創(chuàng)傷會造成不同程度的細胞變性、壞死和組織缺損，必須通過細胞增殖和細胞間質(zhì)的形成來進行組織修復。本實驗采用細胞療法將新生乳鼠的成纖維細胞注入皮膚損傷的動物模型中，研究成纖維細胞在創(chuàng)面修復中的作用[1-2]。

1材料與方法

1.1 材料、藥品與儀器

1.1.1 材料 新生大乳鼠、成年大鼠購于吉林大學醫(yī)學部動物中心。

1.1.2 藥品 PBS緩沖液、40g/L中性蛋白酶、2.5g/lΙ型膠原酶、低糖DMEM、脫毛劑、咪達唑侖麻醉劑、臺盼藍染液、蘇木精染液、伊紅染液、二甲苯、10%中性甲醛、包埋劑、中性樹膠等。

1.1.3 儀器 低速離心機、恒溫搖床、冷凍切片機，超凈工作臺等。

1.2 成纖維細胞體外的分離培養(yǎng)

1.2.1 分離表皮和真皮 新生大乳鼠處死后在75%酒精中浸泡3min，取背部皮膚，用PBS緩沖液洗滌3次，皮膚剪成5mm×5mm的小塊，置入40g/L中性蛋白酶溶液中消化3～4h。取出后PBS緩沖液洗滌，分離表皮層與真皮層，真皮備用。

1.2.2 制備細胞懸液 真皮剪碎后加入0.25%Ⅰ型膠原酶溶液，37℃恒溫搖床振蕩4h，PBS稀釋終止消化，200目尼龍紗網(wǎng)過濾，收集濾液。1200r/min離心5min，棄上清，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，反復吹打制成細胞懸液。臺盼藍染色，細胞計數(shù)[5]，調(diào)整細胞懸液的濃度1.0×107個/ml。

1.3 大鼠皮膚損傷模型的建立及分組

對24只體重75g的大鼠進行乙醚氣體吸入麻醉，腹腔注射1.4ml麻醉藥咪達唑侖稀釋液麻醉，背部用脫毛劑脫毛，常規(guī)消毒背部皮膚，前后各做一皮膚損傷創(chuàng)傷，創(chuàng)傷傷口的直徑約1.5cm，深達皮下，損傷不傷及肌肉，壓迫止血[6]。然后將大鼠隨機分成A、B兩組，A組12只，作為處理組，向創(chuàng)面皮膚真皮內(nèi)注射0.3ml的原液；B組12只，作為對照組，注射等體積的生理鹽水（0.9%的氯化鈉水溶液），為避免腫脹，多選幾個位置進行注射。注射時為皮下注射給藥，分別將成纖維細胞和生理鹽水推入皮下結締組織，經(jīng)毛細血管、淋巴管吸收進入血液循環(huán)。每只小鼠給予清潔飼料及自來水，分籠飼養(yǎng)，并保持創(chuàng)口干燥，用碘伏擦拭于創(chuàng)口處，間隔一天擦拭一次，直到傷后第12d，以防止創(chuàng)口感染。

1.4 觀察指標

1.4.1 創(chuàng)面面積測定 傷后分別于第3d、6d、9d、12d用透明薄膜覆蓋創(chuàng)面并沿創(chuàng)緣劃線。動物致傷后立即測的面積為傷口原始面積。愈合指數(shù)=（1-現(xiàn)切口面積/原切口面積）×100%[2]。

1.4.2 組織學檢查 傷后第12d頸椎脫臼法處死大鼠，畫出創(chuàng)面大小，然后剪下創(chuàng)面內(nèi)肉芽組織，放于10%中性甲醛（福爾馬林）中固定1小時，生理鹽水洗滌，濾紙吸干其上的水后用包埋劑包埋于組織支撐器上，快速放于冷凍臺上冷凍，制作冰凍切片，在光學顯微鏡下觀察，凡可觀察到真皮、表皮層的可進行HE染色，在材料周圍滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，顯微鏡下觀察結果。

1.4.3 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)均以“均數(shù)±標準差（x±s）”表示，使用Excel統(tǒng)計軟件處理，采用方差分析，兩兩比較，使用組間配對t檢驗，P<0.05為有顯著性差異意義[7]。

2 結果與分析

2.1 給藥后創(chuàng)面外觀的變化

處理后的創(chuàng)面面積隨傷后時間延長而不斷縮小[8]，注射了成纖維細胞的創(chuàng)面面積縮小最明顯，愈合程度大，并于傷后第12d創(chuàng)面長出一層較密的毛，而對照組只長有少量的毛。

2.2 創(chuàng)面愈合程度

（t檢驗：平均值的成對二樣本分析，得出P<0.05，與對照組比較。）

造模后，隨時間的延長創(chuàng)面面積逐漸縮小。傷后第3d，兩組大鼠的創(chuàng)面開始逐漸縮小。傷后第12d大部分創(chuàng)面已經(jīng)愈合，A組的愈合程度強于B組，且愈合速度較快。經(jīng)t檢驗，從傷后第9d開始，實驗組細胞層數(shù)較多，分層明顯，創(chuàng)面愈合程度大，顯著高于對照組，有明顯的加速創(chuàng)面面積縮小的作用（P<0.05），差異顯著。

2.3 組織學檢查

在顯微鏡下，可以清晰地觀察到表皮層與真皮層，對比發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)B組細胞分層較為明顯，表皮層明顯增厚，真皮層中成纖維細胞大量增殖，而對照組的表皮層略微增厚（見圖1、圖2、圖3、圖4）。

3 討論

皮膚受損，成纖維細胞是最主要的修復細胞，是構成肉芽組織的主要成分之一。損傷刺激后，成纖維細胞在趨化因子的作用下進入創(chuàng)口并分裂增殖，與毛細血管及滲出的炎細胞構成肉芽組織。在傷后5～7d肉芽組織達到高峰，成纖維細胞數(shù)量劇增，功能活躍[9]。

創(chuàng)面修復是一個復雜的生物學過程，涉及創(chuàng)面炎性翻譯、肉芽組織增生以及再上皮化等主要過程。成纖維細胞應用于創(chuàng)面總的效應是促進創(chuàng)面修復，主要表現(xiàn)在促進新生肉芽組織生長，深入比較處理組與對照組的促修復效果，發(fā)現(xiàn)處理組的效果較明顯，創(chuàng)面愈合程度明顯高于對照組，其愈合作用更強[8]。該細胞療法使細胞再生，從而使大鼠背部皮膚的成纖維細胞增多，并激活大鼠的受損細胞，最終創(chuàng)面愈合。

現(xiàn)已有專家學者提出成纖維細胞分泌的堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）可增強成纖維細胞的活性[10]。他們認為有針對性地應用生長因子，治療既可最大限度發(fā)揮生長因子本身的生物學作用，同時也會避免或預防許多可能的不良反應，以達到經(jīng)濟與最佳的促修復效果。因此，在臨床應用中成纖維細胞可廣泛應用于體表創(chuàng)面修復的研究及醫(yī)療的其他領域[8]。

參考文獻

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作者簡介：曲廣男，在讀本科生，研究方向：生物技術。

通訊作者：馮穎，碩士，講師，研究方向：干細胞細胞生物學。