正交試驗(yàn)優(yōu)化養(yǎng)心安神顆粒提取工藝

曹麗萍 梁奇 李曙光 謝月 張子龍 楊光義

摘要：目的 優(yōu)化養(yǎng)心安神顆粒提取工藝。方法 以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)考察加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油得率的影響；以加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，以提取液中芍藥苷和總固形物含量為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化養(yǎng)心安神顆粒的提取工藝。結(jié)果 最佳提取工藝為：桂枝、防風(fēng)、佛手加8倍量水，蒸餾6 h提取揮發(fā)油；其余藥味加8倍量水煎煮1 h，提取2次。結(jié)論 該提取工藝合理可行，并能較好保證制劑質(zhì)量。

關(guān)鍵詞：養(yǎng)心安神顆粒；揮發(fā)油；芍藥苷；總固形物；高效液相色譜法；正交試驗(yàn)；提取工藝

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.019

中圖分類(lèi)號(hào)：R283.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2018）07-0079-04

Abstract： Objective To optimize the extraction technology for Yangxin Anshen Granules. Methods With yield of volatile oil as index， single factor tests were adopted to investigate effects of water， soaking time and distillation time on extraction technology of volatile oil. Using water amount， extraction time and extraction times as factors， the contents of paeoniflorin and total solid as indexes， orthogonal test was employed to optimize the extraction technology of Yangxin Anshen Granules. Results The optimical extraction technology conditions were as follows： Cinnamomi Ramulus， Saposhkoviae Radix， and Citri Sarcodactylis Fructus were extracted to get volatile oil with eight-folds amount water of herbs for 6 hours； other herbs were boiled with eight-folds amount water of herbs and extrancted for two times， 1 h each time. Conclusion This extraction process is reasonable and practical， and can well guarantee the quality of preparation.

Keywords： Yangxin Anshen Granules； volatile oil； paeoniflorin； total solid； HPLC； orthogonal test； extraction technology

養(yǎng)心安神湯為深圳市寶安區(qū)中醫(yī)院臨床應(yīng)用多年的經(jīng)驗(yàn)方，由白芍、大棗、麩炒白術(shù)、防風(fēng)、桂枝、煅龍骨等14味中藥組成，具有養(yǎng)心安神、調(diào)和營(yíng)衛(wèi)的功效，用于治療睡眠不安、多汗等證。由于顆粒劑具有攜帶和使用方便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，故將其改劑型為養(yǎng)心安神顆粒。本研究在原湯劑水提工藝基礎(chǔ)上對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，初步確定其制備工藝為：桂枝、佛手、防風(fēng)采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油，揮發(fā)油備用，蒸餾后的水溶液備用；白芍等其余11味藥加水煎煮，煎煮液與上述蒸餾后的水溶液合并，合并后的藥液經(jīng)純化后制粒，將揮發(fā)油噴入顆粒中，混勻，即得。本研究以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)優(yōu)選揮發(fā)油提取工藝條件，以加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間為影響因素，以芍藥苷和總固形物含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化水提取工藝，為養(yǎng)心安神顆粒的進(jìn)一步研究與生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀，日本島津公司；Sartori?s BP 211D型電子分析天平，德國(guó)Sartorius公司；101-1BS電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博泰公司。

芍藥苷對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110736-201539，純度96.4%；水為超純水，乙腈為色譜純，德國(guó)默克公司；其他試劑均為分析純；白芍、大棗、麩炒白術(shù)、防風(fēng)、桂枝、煅龍骨、煅牡蠣、山萸肉、醋五味子、浮小麥、燈芯草、合歡皮、佛手、甘草飲片，深圳市宏順昌藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)深圳市中醫(yī)院藥檢室鑒定均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化揮發(fā)油提取工藝

采用單因素試驗(yàn)，以揮發(fā)油得率為指標(biāo)，對(duì)加水量、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)選。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，所得揮發(fā)油比重<1.0，按揮發(fā)油測(cè)定法（2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則2204）甲法提取揮發(fā)油。

2.1.1 加水量考察

按處方比例稱(chēng)取桂枝、防風(fēng)、佛手飲片，每份1150 g，分別加入6、8、10、12倍量水，浸泡1 h，蒸餾提取揮發(fā)油8 h，測(cè)定揮發(fā)油量，計(jì)算揮發(fā)油提取率，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，加8倍量水的揮發(fā)油提取率接近最大值，同時(shí)考慮大生產(chǎn)和成本等因素，確定加8倍量水提取揮發(fā)油。

2.1.2 浸泡時(shí)間考察

按處方比例稱(chēng)取桂枝、防風(fēng)、佛手飲片，每份1150 g，加入10倍量水，浸泡0、0.5、1、2 h，提取揮發(fā)油8 h，測(cè)定揮發(fā)油量，計(jì)算揮發(fā)油提取率，結(jié)果見(jiàn)表2。可見(jiàn)，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，揮發(fā)油提取率無(wú)明顯增加，考慮大生產(chǎn)和成本等因素，選擇不浸泡，直接提取。

2.1.3 提取時(shí)間考察

按處方比例稱(chēng)取桂枝、防風(fēng)、佛手飲片，每份1150 g，分別加入8倍量水，每隔1 h記錄揮發(fā)油體積，計(jì)算揮發(fā)油得率，結(jié)果見(jiàn)表3?？梢?jiàn)，提取時(shí)間對(duì)揮發(fā)油收率有明顯影響，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，揮發(fā)油提取率明顯增加，但提取6 h與8～10 h比較，揮發(fā)油提取率相差不大，同時(shí)考慮大生產(chǎn)和成本等因素，確定揮發(fā)油提取時(shí)間為6 h。

2.1.4 揮發(fā)油提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

稱(chēng)取桂枝、防風(fēng)、佛手飲片共3份，每份1150 g，加8倍量水，蒸餾回流提取6 h，揮發(fā)油提取率分別為0.067%、0.065%、0.065%，平均0.065%，RSD=0.25%，表明該提取工藝穩(wěn)定、可行。

2.2 芍藥苷含量測(cè)定

除桂枝、防風(fēng)、佛手外，白芍等其余11味藥加水煎煮，煎煮液濃縮至500 mL，作為供試品貯備液，供芍藥苷含量測(cè)定和總固形物測(cè)定用。

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

取芍藥苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1 mL含109.3 ?g芍藥苷的對(duì)照品貯備液，分別精密量取對(duì)照品貯備液1、2、4、6、8、10 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成系列對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密量取正交試驗(yàn)各供試品貯備液2 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

取系列對(duì)照品溶液，按上述條件分別進(jìn)樣10 ?L，測(cè)得峰面積。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程為Y=12 515.048 2X-6681.463 0，r=0.999 9，結(jié)果表明芍藥苷在10.93～109.3 ?g/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取芍藥苷對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 ?L，測(cè)定峰面積，RSD=0.52%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于放置0、2、4、8、12 h進(jìn)樣測(cè)定芍藥苷峰面積，結(jié)果RSD=0.76%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品貯備液6份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定芍藥苷含量。結(jié)果供試品貯備液中芍藥苷平均含量為256.7 ?g/mL，RSD=0.77%，表明重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知芍藥苷含量（256.7 ?g/mL）的貯備藥液，共9份，每份1 mL，分別加對(duì)照品溶液（109.3 ?g/mL）2 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，結(jié)果芍藥苷平均回收率為99.7%，RSD=1.4%，見(jiàn)表4。

2.2.9 含量測(cè)定

精密量取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 ?L，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定藥液中芍藥苷含量。

2.3 總固形物測(cè)定

精密量取供試品貯備液100 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿，濃縮至干，于105 ℃干燥至恒重，得干膏，計(jì)算總固形物。

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化水提工藝

2.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化白芍等11味藥的水提工藝。以加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間為影響因素，每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，選用L9（34）正交表，試驗(yàn)安排及結(jié)果見(jiàn)表5～表7。

由極差R可知，提取次數(shù)對(duì)芍藥苷提取量的影響最大，各因素影響大小順序?yàn)椋禾崛〈螖?shù)（C）>加水量（A）>提取時(shí)間（B）。方差分析表明，因素C（提取次數(shù)）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響（P<0.05），因素A（加水量）和因素B（提取時(shí)間）對(duì)試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著影響（P<0.10）。故選擇提取工藝為A1B1C2，即：提取2次，每次加8倍量水，每次提取1 h。

2.4.2 水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

取上述飲片共6份，按優(yōu)選的提取工藝，即每次加8倍量水煎煮1 h，共煎煮2次，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至250 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定芍藥苷含量，按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定總固形物，結(jié)果芍藥苷平均121.0 mg，總固形物平均25.3 g，見(jiàn)表8。表明按優(yōu)選的工藝進(jìn)行提取，芍藥苷和總固形物含量接近最大值，該工藝合理可行。

3 討論

白芍為方中君藥，具有養(yǎng)血、斂陰止汗的功效[1]，其發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是單萜及其苷類(lèi)、三萜類(lèi)和多糖等化合物，主要有效成分是芍藥苷，具有抗自由基損傷、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載和抗神經(jīng)毒性等活性，能降低血液黏度、抗血小板聚集，保護(hù)神經(jīng)等[2-6]。

方中佛手、桂枝、防風(fēng)均含有揮發(fā)油活性成分[7]。夏倫祝等[8]通過(guò)不同方法提取防風(fēng)揮發(fā)油，出油率為0.77%～5.23%。趙興杰等[9]提取佛手揮發(fā)油，得率為0.3%～1.19%。桂枝揮發(fā)油含量為0.2%～0.9%，其主要成分為桂皮醛，桂枝對(duì)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有鎮(zhèn)靜和抗焦慮作用，桂皮醛可縮短大鼠睡眠潛伏期，增加睡眠持續(xù)時(shí)間[10]；防風(fēng)揮發(fā)油協(xié)同色原酮等其他成分發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[11]；佛手揮發(fā)油具有止咳平喘祛痰、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[12]。故本研究在原湯劑的基礎(chǔ)上增加揮發(fā)油的提取，減少有效成分的損失。

芍藥苷藥效具有代表性，故選為主要指標(biāo)，綜合評(píng)分權(quán)重定為60%[13-15]。總固形物中其他成分對(duì)本方功效共同發(fā)揮作用，故設(shè)定總固形物權(quán)重為40%。

本研究通過(guò)芍藥苷及總固形物含量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化養(yǎng)心安神顆粒提取工藝，較好地保證了制劑質(zhì)量。最終確定的提取工藝為：桂枝、佛手、防風(fēng)加8倍量水，提取6 h，蒸餾后的水溶液另器收集；白芍等其余11味加水煎煮3次，每次加8倍量水，每次1 h。驗(yàn)證試驗(yàn)表明該工藝穩(wěn)定可行，為養(yǎng)心安神顆粒的研制和生產(chǎn)提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2018-01-25）

（修回日期：2018-03-06；編輯：陳靜）