羊棲菜多酚的提取及純化工藝研究

呂成林，汪秋寬，宋悅凡，任丹丹，何云海

（大連海洋大學(xué)，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室，國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧大連 116023）

羊棲菜多酚的提取及純化工藝研究

呂成林，汪秋寬*，宋悅凡，任丹丹，何云海

（大連海洋大學(xué)，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室，國家海藻加工技術(shù)研發(fā)分中心，遼寧大連 116023）

以羊棲菜為原料，研究確定經(jīng)濟高效的羊棲菜多酚提取分離純化的方法。檢測分析乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度參數(shù)對多酚粗提物提取率的影響，優(yōu)化得到羊棲菜多酚粗提物的最佳提取工藝為：乙醇濃度40%、料液比1∶25、提取時間5h、提取溫度70℃。以多酚吸附量和解吸率為指標，對10種不同類型的大孔樹脂進行了篩選，通過動態(tài)吸附與解吸實驗，確定大孔樹脂的最佳吸附條件。綜合分析結(jié)果表明大孔樹脂NKA-9對羊棲菜多酚的吸附量和解吸率最佳，吸附量和解吸率分別達到0.73mg/g和91%。NKA-9樹脂分離最佳工藝條件為：上柱液pH為4，體積為300mL，流速為1mL/min；洗脫液濃度為70%，洗脫液體積為400mL，洗脫流速為1mL/min。

羊棲菜，多酚，大孔樹脂，純化

海藻生物資源豐富，據(jù)報道種屬超過15000種[1]。與陸地植物相比，海藻具有許多特殊的成分，現(xiàn)已成為海洋生物活性物質(zhì)的新來源[2]。海藻多酚廣泛存在于海藻體內(nèi)，因其具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒[3-5]等多種生物活性，越來越受到人們的關(guān)注，是開發(fā)利用海洋藥物的潛在來源。

羊棲菜，又名鹿角尖、海大麥，隸屬于褐藻門、馬尾藻科、馬尾藻屬。中國北起遼東半島，南至雷州半島，均有它的分布；以浙江沿海最多。研究表明，我國常見的褐藻（包括海帶、裙帶菜、鼠尾藻、海黍子、羊棲菜等）均含有數(shù)量不等的多酚，而羊棲菜多酚含量高達干重的2%，海黍子2.8%[6]。關(guān)于羊棲菜中多酚類物質(zhì)的提取已有研究，包括傳統(tǒng)的溶劑提取法和超聲提取法，然而對羊棲菜中多酚的純化研究卻鮮有報道[7]。多酚廣泛應(yīng)用在農(nóng)業(yè)、環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，發(fā)揮著重要的作用。多酚類物質(zhì)在農(nóng)業(yè)上可以起到生物農(nóng)藥和生長激素的作用來抵抗病蟲害[8]；在生態(tài)環(huán)境保護中降低廢水中的重金屬含量，緩解植物酸鋁毒害[9-10]；在食品工業(yè)中還可用作天然的抗氧化劑和保鮮劑[11-12]；在醫(yī)藥領(lǐng)域也發(fā)揮著抑菌抗病毒、抗癌、預(yù)防心血管疾病等重要作用[13-14]。目前關(guān)于多酚類物質(zhì)的提取、分離純化主要采用的是溶劑提取和大孔樹脂純化。本實驗選擇了10種大孔吸附樹脂純化羊棲菜多酚，并對其提取工藝和純化工藝進行了優(yōu)化，為羊棲菜多酚類物質(zhì)的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊棲菜 購于浙江省溫州市，實驗前粉碎至粉，備用；大孔樹脂ADS-7、ADS-17、NKA-2、NKA-9、H103、S-8、X-5 南開大學(xué)化工廠；大孔樹脂HPD-750、HPD-BJHQ、AB-8 滄州寶恩吸附材料科技有限公司；無水乙醇、碳酸鈉、沒食子酸 均為分析純，天津市富宇精細化工有限公司；福林酚 Sigma。

FW100高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；RE-52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；722S分光光度計 上海分析儀器總廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的制作及羊棲菜多酚含量測定 精確稱取沒食子酸標準品100mg，蒸餾水定容至1000mL，得到0.1mg/mL的標準溶液。準確吸取沒食子酸標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于10mL帶蓋試管中，加入2.5mL 10%福林酚試劑，反應(yīng)5min后，加入2mL 7.5%Na2CO3溶液，混勻定容至10mL，避光反應(yīng)2h，蒸餾水調(diào)零，760nm波長處測定吸光度值A(chǔ)[15]。以沒食子酸標準溶液的濃度（μg/mL）為橫坐標，以吸光度A為縱坐標作沒食子酸（GA）標準曲線。

羊棲菜多酚粗提液用蒸餾水定容于100mL容量瓶中，取0.5mL待測樣品，加入2.5mL 10%福林酚試劑，反應(yīng)5min后，加入2mL 7.5%Na2CO3溶液，混勻定容至10mL，避光反應(yīng)2h，蒸餾水調(diào)零，760nm波長處測定吸光度。利用沒食子酸（GA）標準曲線計算相應(yīng)的總酚含量（mgGA樣品/g樣品提取物干重）。

1.2.2 單因素實驗考察羊棲菜多酚粗提物提取工藝條件 稱取5.00g羊棲菜粉末，加入1∶20（v/m）的60%乙醇溶液，50℃浸提6h，抽濾，合并上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，測定多酚含量。分析乙醇濃度、料液比、提取時間、提取溫度對多酚粗提物提取得率的影響，以多酚含量為檢測指標，以乙醇濃度（25%、40%、60%、80%、95%）、料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、提取時間（2、4、6、8、10h）、提取溫度（30、40、50、60、70℃）作為實驗因素，研究各個因素對羊棲菜多酚粗提物提取率的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用4因素3水平正交設(shè)計探討羊棲菜多酚提取的最佳工藝，正交實驗因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 The orthogonal factor level table

1.2.3 大孔樹脂純化羊棲菜多酚

1.2.3.1 樹脂的預(yù)處理及再生 各種大孔吸附樹脂用無水乙醇在室溫下密封浸泡24h，使其充分溶脹，然后用蒸餾水洗至中性；再用5%的鹽酸溶液浸泡12h，蒸餾水洗至中性；最后用5%的NaOH溶液浸泡12h，蒸餾水洗至中性，備用。

樹脂每次處理過多酚后需再生，先用無水乙醇浸泡24h，用蒸餾水洗至中性后再按預(yù)處理方法用5%鹽酸溶液和5%NaOH溶液處理，備用[16]。

1.2.3.2 靜態(tài)吸附與解吸實驗 分別稱取預(yù)處理好的10種大孔樹脂各5g，濾紙吸干表明水分，置于250mL錐形瓶中，加入已知濃度的羊棲菜多酚溶液50mL，于恒溫振蕩器中，25℃振蕩吸附24h，充分吸附后，過濾，測定上清液中多酚濃度。并計算吸附量Q（mg/g）及吸附率E（%）[17]。

式中：C0為吸附前的多酚溶液濃度，mg/mL；C1為吸附后的多酚溶液濃度，mg/mL；V0為多酚粗提液體積mL；m為樹脂的質(zhì)量，g。

樹脂靜態(tài)吸附后，過濾，將吸附飽和后的樹脂置于錐形瓶中，加入70%乙醇50mL，置于25℃水浴搖床振蕩24h，充分解吸后，計算解吸率D（%）。

式中：C0為吸附前的多酚溶液濃度，mg/mL；C1為吸附后的多酚溶液濃度，mg/mL；C2為解吸后的多酚溶液濃度，mg/mL。

1.2.3.3 NKA-9樹脂動態(tài)吸附實驗 將預(yù)處理好的NKA-9樹脂濕法裝柱，裝入Φ2.6cm×30cm層析柱，蒸餾水平衡，加入一定量的多酚粗品溶液，充分吸附后，先用蒸餾水洗，去除多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再用乙醇溶液洗脫，部分收集，合并含多酚的部分，檢測多酚含量。分別考察上樣流速（mL/min）、上樣體積（BV）、樣液pH及洗脫流速（mL/min）、洗脫液體積（BV）、洗脫液濃度對吸附和解吸的影響。

2 結(jié)果分析

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

2.1 沒食子酸（GA）標準曲線

沒食子酸標準曲線見圖1，以吸光度為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程Y=0.0859X+0.0291（R2=0.9994），結(jié)果表明，沒食子酸濃度在0.001~0.010mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 羊棲菜多酚提取單因素實驗及正交優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對多酚粗提物提取得率的影響 乙醇濃度對羊棲菜多酚粗提物得率的影響見圖2。由圖2可知隨著乙醇濃度的升高，羊棲菜多酚粗提物得率有上升的趨勢，但當乙醇濃度超過40%時羊棲菜多酚粗提物得率開始下降。這是因為乙醇濃度過高會使醇溶性雜質(zhì)、色素成分溶出，導(dǎo)致提取率下降，而乙醇濃度較低時，褐藻膠等糖類物質(zhì)和水互溶影響多酚的提取得率，因此本實驗選擇30%、40%、50%作正交優(yōu)化實驗。

圖2 乙醇濃度對多酚粗提物提取得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction of polyphenols

2.2.2 料液比對多酚粗提物提取得率的影響 料液比對羊棲菜多酚粗提物得率的影響見圖3，由圖3可知隨著料液比不斷加大，多酚粗提物得率逐漸增大，當料液比超過1∶20時多酚粗提物得率開始下降，料液比過高，醇溶性雜質(zhì)浸出率增高，對后續(xù)處理不利，同時造成溶劑的浪費。因此本實驗選擇選擇1∶15、1∶20、1∶25作正交優(yōu)化實驗。

圖3 料液比對多酚粗提物提取得率的影響Fig.3 Effect of liquid to solid ratio on extraction of polyphenols

2.2.3 提取時間對多酚粗提物提取得率的影響 提取時間對羊棲菜多酚粗提物得率的影響見圖4。由圖4可知隨著提取時間的增加，多酚粗提物得率逐漸升高，當提取時間為6h時，多酚含量達到最高。而過長時間的提取并不能顯著增加多酚的提取效率。提取時間過長，多酚易發(fā)生降解、氧化等化學(xué)反應(yīng)致使多酚分子結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的破壞，綜合考慮，本實驗選擇4、5、6h作正交優(yōu)化實驗。

圖4 時間對多酚粗提物提取得率的影響Fig.4 Effect of time on extraction of polyphenols

2.2.4 溫度對多酚粗提物提取得率的影響 提取溫度對羊棲菜多酚粗提物得率的影響見圖5。由圖5可知溫度對多酚粗提物的提取率具有顯著的影響。隨著溫度的升高，提取率逐漸上升。溫度升高，提取液的粘度下降，分子運動加速，氫鍵更易斷裂，多酚的滲透、溶解、擴散速度也加快，因而多酚類物質(zhì)更易于溶出。但溫度過高也會使多酚發(fā)生氧化或者降解等一些不可逆的化學(xué)反應(yīng)[18-19]，同時也會增加相應(yīng)的生產(chǎn)成本，因此本實驗選擇50、60、70℃作正交優(yōu)化實驗。

圖5 溫度對多酚粗提物提取得率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction of polyphenols

2.2.5 正交實驗結(jié)果分析 實驗結(jié)果見表2。根據(jù)表2極差分析R的大小，決定因素的影響次序。各因素對羊棲菜多酚粗提物得率影響大小順序為C＞D＞A＞B，即料液比＞提取溫度＞乙醇濃度＞提取時間。按照各因素的最優(yōu)水平選取理論最佳組為C3D3A2B2，即料液比1∶25、提取溫度70℃、乙醇濃度40%、提取時間5h，此時總酚含量為：4.60±0.05（mgGA/g），高 于 最 佳 優(yōu)化 實 驗 組 C2D3A2B1提 取 的 總 酚 含 量 4.45（mgGA/g）。

2.3 各種樹脂對羊棲菜多酚粗提物的吸附與解吸

按1.2.3.2的方法測定十種不同樹脂對羊棲菜多酚粗提物的靜態(tài)吸附和解吸情況，結(jié)果見表3，由表3可知NKA-9大孔樹脂效果最好，其樹脂結(jié)構(gòu)為交聯(lián)聚苯乙烯，對生物堿的分離，黃酮、多酚類物質(zhì)的提取具有顯著的效果。雖然ADS-7和S-8兩種樹脂的吸附性能良好，但其解吸率卻很低，其樹脂極性較強，對多酚吸附牢固，解吸較為困難。而NKA-9樹脂吸附率適中，解吸效果極佳，從產(chǎn)品回收的角度出發(fā)，本實驗選用NKA-9樹脂分離純化羊棲菜多酚粗提物，并進行進一步的優(yōu)化實驗。

表2 L9（34）正交實驗表Table 2 Orthogonal test table

表3 多酚的吸附與解吸性能比較Table 3 The adsorption and desorption properties of polyphenols compared

2.3.1 上樣流速對吸附的影響 上樣速度主要是影響溶質(zhì)向樹脂表面的擴散，流速不同則樹脂達到吸附飽和時的吸附量也不同。上樣速度慢，雖有利于樹脂對多酚物質(zhì)的吸附，但也會延長樹脂達到吸附飽和的時間，降低樹脂吸附的效率。但當上樣速度過快時，溶液中的多酚物質(zhì)還未擴散到樹脂的內(nèi)表面，就被沖出柱子，從而造成樹脂吸附率的下降[20]。吸光度值可直接反映多酚含量的多少，為了便于比較，以吸光度值作為參照標準，下文保持一致。從圖6中可以看出，不同的上樣速率，多酚的泄露點和飽和點不同，考慮到吸附的高效性和降低樣液的浪費，要盡可能的快速吸附，并提高多酚的吸附量。因此，控制上樣速度為1.0mL/min較好。

2.3.2 樣液體積對吸附的影響 按1.2.3.3的方法上柱，控制流速為1mL/min，充分吸附飽和后，測定羊棲菜多酚在NKA-9大孔樹脂上的動態(tài)吸附曲線。如圖7所示，當流出液體積達到300mL左右時吸附達到飽和，流出液濃度基本不變，說明NKA-9大孔樹脂對羊棲菜多酚具有較好的動態(tài)吸附性能，從而確定上柱液的體積。

圖6 流速對多酚吸附的影響Fig.6 Effect of feeding rate on adsorption

圖7 多酚動態(tài)吸附曲線Fig.7 Dynamic adsorption curve of polyphenols

2.3.3 樣液pH對吸附影響 如圖8所示，溶液的pH過高或過低時，樹脂的吸附量都相對較低。當溶液的pH為4時，樹脂對羊棲菜多酚的吸附量最高。羊棲菜多酚提取液中含有一些酚酸類物質(zhì)，其提取液呈酸性[21]，因此酸性條件下有利于多酚物質(zhì)的吸附，所以調(diào)整溶液pH為4，可提高樹脂的飽和吸附量。

圖8 pH對多酚吸附的影響Fig.8 Effect of pH value on adsorption

2.3.4 洗脫液濃度對解吸的影響 本實驗選擇無毒的乙醇作為解吸劑。選取50%、60%、70%、80%、90%等五種不同濃度的乙醇溶液對靜態(tài)飽和吸附的樹脂進行解吸，比較上清液多酚含量。由圖9可知，隨著乙醇溶液濃度的升高，解吸率也隨之增加，因為較低濃度的乙醇無法有效地破壞樹脂與多酚之間形成的氫鍵，導(dǎo)致解吸率較低[22]。當乙醇濃度增加到70%時，解吸率最高，繼續(xù)增加乙醇濃度解吸率下降，雖然也相對較高。但考慮到高濃度乙醇易揮發(fā)且增加生產(chǎn)成本，因此選擇70%的乙醇溶液作為解吸劑。

圖9 乙醇濃度對解吸率的影響Fig.9 Effect of the concentration of ethanol on desorption ratio

2.3.5 洗脫液體積解吸的影響 根據(jù)上述實驗確定的吸附條件飽和吸附后，用70%的乙醇溶液以1mL/min進行洗脫，繪制洗脫曲線，觀察多酚含量與洗脫劑用量的關(guān)系。如圖10所示，當洗脫液體積達到75mL時多酚開始洗脫出來，洗脫液體積達到400mL時，多酚基本都被洗脫下來，結(jié)果表明，NKA-9大孔樹脂具有良好的洗脫性能，洗脫體積確定為400mL。

圖10 多酚動態(tài)解吸曲線Fig.10 Dynamic desorption curve of polyphenols

2.3.6 洗脫流速對解吸的影響 根據(jù)上述實驗確定的吸附流速，選擇0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL/min五個洗脫流速來考察動態(tài)洗脫的效果。從圖11可以看出，不同的洗脫速率對洗脫效果有較大的影響。較低的流速能增加洗脫劑在樹脂柱中停留的時間，有利于洗脫劑向樹脂內(nèi)部擴散，同樣也會增加工作周期；而流速過快，洗脫劑不能與被吸附的多酚進行充分作用而將其從樹脂的吸附位點置換出來，洗脫不完全，效率很低[23]。因此選取1.0mL/min為最佳洗脫流速。

圖11 流速對多酚解吸的影響Fig.11 Effect of elution rate on desorption

3 結(jié)論

3.1 正交優(yōu)化羊棲菜多酚的最佳提取工藝：乙醇濃度40%、料液比1∶25、提取時間5h、提取溫度70℃。

3.2 多酚含量測定的沒食子酸標準曲線：Y=0.0859X+ 0.0291（R2=0.9994），線性關(guān)系良好。

3.3 運用靜態(tài)吸附與解吸實驗篩選出適用于羊棲菜多酚分離純化的大孔樹脂NKA-9。

3.4 通過羊棲菜多酚在NKA-9樹脂上的動態(tài)吸附研究，確定了最佳吸附條件為：上樣流速1min/mL、上樣體積300mL、樣液pH4.0；最佳洗脫條件為：洗脫流速1mL/min、乙醇濃度70%、洗脫體積400mL。且經(jīng)樹脂純化后得到的羊棲菜多酚純度達到干基的11.4%。

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Study on the extraction and purification of polyphenols from Sargassum fusiforme

LV Cheng-lin，WANG Qiu-kuan*，SONG Yue-fan，REN Dan-dan，HE Yun-hai
（Key Laboratory of Aquatic Product Processing and Utilization of Liaoning Province，National R＆D Branch Center For Seaweed Processing（Dalian），Dalian Ocean University，Dalian 116023，China）

Studies were carried out on the technology for separating polyphenols crude extract from Sargassum fusiforme efficiently and economically.The ethanol concentration，solid-liquid ratio，extraction time and extraction temperature were optimized by orthogonal test depending on their effects on polyphenols crude extract extracting yield.The optimized factors were ethanol concentration of 40% ，solid-liquid ratio 1∶25，extraction time 5h and extraction temperature 70℃ .Ten different types of macroporous resin were surveyed and selected when the adsorption capacity and desorption rate taken as indicators.The adsorption conditions of the selected macroporous resin were determined by dynamic adsorption and desorption experiment.The results showed that NKA-9 resin had the best adsorption capacity and static desorption rate for the polyphenols from Sargassum fusiforme.The adsorption capacity and desorption rates were 0.73mg/g and 91%respectively.The optimum conditions for elution were column liquid pH4，liquid column volume 300mL，feeding rate 1mL/min；eluent concentration 70%，eluent volume 400mL，elution rate 1mL/min.

Sargassum fusiforme；polyphenols；macroporous resin；purification

TS254

B

1002-0306（2014）22-0231-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.042

2014－03－17

呂成林（1988-）男，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

* 通訊作者：汪秋寬（1962-），女，碩士研究生，教授，研究方向：海藻精深加工關(guān)鍵技術(shù)及綜合利用。

公益性行業(yè)（海洋）科研專項（201405040）。