應(yīng)用血栓彈力圖評(píng)價(jià)烏司他丁的體外抗凝作用

宋景春，胡 煒，楊 洋，林青偉，曾慶波，鄧星平

0 前 言

烏司他丁(ulinastatin, UTI)是從健康男性尿液中提取的酸性糖蛋白，由143個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約 67 000，屬蛋白酶抑制劑[1]。烏司他丁對(duì)胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶具有良好的抑制作用,并能減少中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶的釋放，穩(wěn)定溶酶體膜并抑制溶酶體酶的釋放[2-3]。藥品說明書限定烏司他丁主要用于治療急性胰腺炎和急性循環(huán)衰竭的搶救，推薦劑量為每次10萬IU靜脈注射，1天3次[4]。另有研究報(bào)道烏司他丁具有很強(qiáng)的抗炎作用，并在膿毒癥、感染性疾病、腎病、體外循環(huán)和腫瘤等疾病領(lǐng)域也有良好的療效，使用劑量上甚至有使用每日1000萬IU持續(xù)靜脈注射的報(bào)道，但這種超適應(yīng)證和超劑量的使用方法，迄今仍缺乏有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)[5-8]。究其原因，難以廣泛開展超適應(yīng)證、超劑量使用烏司他丁進(jìn)行高質(zhì)量的臨床研究至關(guān)重要。

血栓彈力圖儀(thromboelastography，TEG)是針對(duì)全血標(biāo)本的凝血檢測(cè)設(shè)備，能夠在體外通過測(cè)定血栓形成速度、強(qiáng)度和溶解過程，真實(shí)而全面地反映凝血功能狀態(tài)[9-10]。因此，本研究擬嘗試通過血栓彈力圖儀在體外評(píng)價(jià)超劑量烏司他丁對(duì)健康人群凝血狀態(tài)的影響。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇年齡≥18歲的健康志愿者20名，年齡22～38歲，平均年齡(27.6±5.04)歲。其中男10名，平均年齡(29.3±6.2)歲；女10名，平均年齡(25.9±2.96)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：具有遺傳性凝血病或其他影響凝血功能的疾病，3個(gè)月內(nèi)有服藥史。所有對(duì)象均空腹從肘靜脈采血4 mL，置于枸櫞酸抗凝管中(枸櫞酸血液比例為1∶9)。將10萬單位烏司他丁溶于1 mL 0.9%氯化鈉注射液，配成100 IU/μL的烏司他丁溶液。將每名志愿者的4 mL靜脈血分為1 mL血標(biāo)本4份，根據(jù)烏司他丁的使用劑量設(shè)置空白對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。其中空白對(duì)照組按說明書進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)，低、中、高劑量組分別加入10、20、40 μL烏司他丁溶液至1 mL血標(biāo)本中，低、中、高劑量組烏司他丁終濃度依次為1000、2000、4000 IU/mL。根據(jù)性別設(shè)置亞組分析，分為男性空白對(duì)照組及低、中、高劑量組和女性空白對(duì)照組及低、中、高劑量組。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：LC2018005)，所有志愿者均自愿參與本研究并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1儀器和試劑血栓彈力圖儀(西芬斯，北京樂普醫(yī)療科技)及配套試劑(包括高嶺土試劑瓶、0.2 mol/L氯化鈣和普通杯等),烏司他丁(廣東天普生化醫(yī)藥)，0.9%氯化鈉注射液。

1.2.2血栓彈力圖檢測(cè)按說明書操作步驟進(jìn)行，所有血樣本均在40 min內(nèi)完成TEG監(jiān)測(cè)。測(cè)試完畢后，記錄血栓彈力圖的主要參數(shù)，包括凝血反應(yīng)時(shí)間(R)、血塊形成速率(K)、血塊形成動(dòng)力學(xué)(α角)、血塊最大強(qiáng)度(MA)和凝血綜合指數(shù)(CI)。R時(shí)間反映參加凝血啟動(dòng)過程的凝血因子的綜合作用，正常范圍為4～8 min。K時(shí)間是從R時(shí)間終點(diǎn)到描記幅度達(dá)到20 mm所需的時(shí)間，反映血凝塊形成的速率，代表纖維蛋白聚合并與血小板交互反應(yīng)形成血塊的過程，正常值為1～4 min。α角是從血凝塊形成點(diǎn)到描記圖最大的曲線弧度處作切線與水平線的夾角，正常范圍為47°～74°。α角與K時(shí)間密切相關(guān)，影響因素均為纖維蛋白原和血小板。MA反映血凝塊的最大強(qiáng)度，主要受血小板和凝血因子XⅢ的影響，正常值為55～73 mm。CI反映樣本在各種條件下凝血的綜合狀態(tài)，<-3為低凝，>+3為高凝。

2 結(jié) 果

2.1不同劑量烏司他丁對(duì)健康人血栓彈力圖參數(shù)的影響與空白對(duì)照組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組R值和K值均顯著延長(P<0.05)，α角、MA和CI均顯著降低(P<0.05)。與低劑量組比較，中劑量組R值和K值顯著延長，α角、MA和CI均顯著降低(P<0.05)。同樣與低劑量組比較，高劑量組的R值顯著延長(P<0.05)，MA和CI顯著降低(P<0.05)，中劑量組和高劑量組在各項(xiàng)指標(biāo)上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2不同劑量烏司他丁對(duì)健康男性血栓彈力圖參數(shù)的影響與男性空白對(duì)照組比較，男性低劑量組R、K、α角、MA和CI參數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與男性空白對(duì)照組和男性低劑量組比較，男性中劑量組和男性高劑量組的R值和K值均顯著延長(P<0.05)，α角、MA和CI均顯著降低(P<0.05)。見表2。

2.3不同劑量烏司他丁對(duì)健康女性血栓彈力圖參數(shù)的影響與女性空白對(duì)照組比較，女性低、中、高劑量組的R值和K值均明顯延長(P<0.05)，α角、MA值和CI均顯著降低(P<0.05)。但女性低、中、高劑量組各組間的R值、K值、α角、MA和CI差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。見表2。

3 討 論

烏司他丁是一種尿胰蛋白酶抑制劑, 有報(bào)道烏司他丁可改善膿毒癥患者免疫、心臟及其他各臟器功能,臨床上已用于抗急性組織損傷、減弱炎癥損害等方面[11-12]。近年來有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道烏司他丁對(duì)凝血系統(tǒng)也有一定的影響，如Ge等[13]報(bào)道烏司他丁可以糾正血液的高凝狀態(tài)，降低手術(shù)后下肢深靜脈血栓(DVT)的發(fā)生率。Kim等[14]報(bào)道烏司他丁可能通過延長體外循環(huán)(CPB)后患者的凝血酶原時(shí)間(PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)，從而影響凝血功能。臨床上經(jīng)實(shí)踐大劑量烏司他丁治療彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)有效[8]，但具體的機(jī)制并不清楚，也缺乏標(biāo)準(zhǔn)。TEG是一種接近人體生理水平和內(nèi)環(huán)境的檢測(cè)方式，其通過微量的全血檢測(cè)能對(duì)凝血因子、纖維蛋白原、血小板聚集功能以及纖維蛋白溶解等方面進(jìn)行凝血全貌的檢測(cè)和評(píng)估。本研究即采用TEG評(píng)價(jià)不同劑量烏司他丁的體外抗凝作用。

組別R(min)K(min)α角(°)MA(mm)CI空白對(duì)照組7.97±1.74 2.20(1.80, 3.08)55.17±10.3760.92±5.32-2.27±2.58低劑量組10.27±1.72?3.60(2.65, 3.88)?48.38±9.29?56.01±5.54?-5.23±2.28?中劑量組11.96±2.61?#4.90(3.43, 5.58)?#39.58±11.03?#47.68±6.94?#-8.56±3.49?#高劑量組12.66±2.42?#3.75(2.88, 5.15)?44.84±10.33?50.10±7.95?#-8.03±3.47?#與空白對(duì)照組比較,?P<0.05;與低劑量組比較,#P<0.05

組別R(min)K(min)α角(°)MA(mm)CI男性 空白對(duì)照組9.22±1.312.98±0.8447.71±8.4958.93±5.19-4.08±2.02 低劑量組10.47±2.113.26±0.7849.80±7.7657.02±5.81-5.08±2.39 中劑量組13.25±2.58?#5.64±1.26?#33.42±8.29?#45.01±3.28?#-10.51±3.03?# 高劑量組13.73±1.99?#4.35±1.46?#△42.29±8.37?#△48.39±5.68?#-9.26±2.68?#女性 空白對(duì)照組6.71±1.091.99±0.4462.63±5.5962.90±4.92-4.05±1.63 低劑量組10.07±1.55▲3.42±0.85▲46.96±10.83▲55.00±5.37▲-5.37±2.29▲ 中劑量組10.66±2.00▲3.99±1.86▲45.73±10.20▲50.35±8.66▲-6.60±2.83▲ 高劑量組11.59±2.42▲3.73±1.42▲47.39±11.87▲51.81±9.73▲-6.80±3.85▲與男性空白對(duì)照組比較,?P<0.05;與男性低劑量組比較,#P<0.05;與男性中劑量組比較,△P<0.05;與女性空白對(duì)照組比較,▲P<0.05

凝血因子、血小板和纖維蛋白原在止血和血栓形成過程中各自扮演著重要角色。血小板是一期止血的基礎(chǔ)，為凝血系統(tǒng)活化及凝血酶的最終形成提供磷脂表面，并且活化血小板可釋放多種促凝物質(zhì)；纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，作為凝血因子I直接參與凝血過程，其被凝血酶裂解后形成的纖維蛋白單體，是血栓的重要成分，同時(shí)纖維蛋白原是參與血小板聚集的重要輔助因子，在激活的血小板之間作為橋梁與血小板膜上的糖蛋白受體(GpⅡb/Ⅲa)結(jié)合，從而促進(jìn)血小板聚集和血栓形成[15]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，低劑量、中劑量、高劑量組的R值和K值均顯著延長，α角、MA和CI均顯著降低，說明烏司他丁能改變血塊的動(dòng)力學(xué)，通過抑制凝血因子活性、降低纖維蛋白原和血小板功能方面產(chǎn)生低凝效應(yīng)。中劑量和高劑量組的R值較低劑量組延長，MA和CI降低，提示隨劑量的增加，烏司他丁對(duì)凝血因子活性和血小板功能抑制作用增強(qiáng)。

凝血因子多是絲氨酸蛋白酶，其活性部位均含有一個(gè)必不可少的絲氨酸殘基。烏司他丁是絲氨酸蛋白酶抑制劑，能通過抑制凝血因子Ⅴ、Ⅷ、Ⅻ等的過度激活從而減少凝血因子的消耗。這是烏司他丁抗凝作用的機(jī)制之一。Pugia等[16]報(bào)道烏司他丁第二個(gè)Kunitz結(jié)構(gòu)域能夠影響凝血因子, 尤其是X因子活性，同時(shí)還可以抑制血小板聚集。Nishiyama等[17]報(bào)道腹部手術(shù)前應(yīng)用烏司他丁可以降低術(shù)后纖維蛋白降解產(chǎn)物(FDP)、纖溶酶-纖溶酶原抑制物復(fù)合物(PIC)和凝血酶-抗凝血酶復(fù)合物(TAT) 水平，抗凝血酶(AT)下降的幅度也較未使用烏司他丁的患者要低。這些研究結(jié)果均與本研究的結(jié)論相符。

對(duì)于健康男性，與對(duì)照組比較，低劑量組的各參數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但中劑量組的R值與K值延長，α角、MA和CI均降低；高劑量組的R值顯著延長，MA和CI均顯著降低，α角無顯著差異。這說明烏司他丁劑量增加到2000 IU/mL時(shí)，才對(duì)男性具有顯著的抗凝作用。而對(duì)于健康女性，與對(duì)照組比較，低劑量、中劑量、高劑量組的R值和K值延長，α角、MA和CI降低，然而低劑量組、中劑量組與高劑量組之間各參數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說明1000 IU/mL的烏司他丁就對(duì)女性具有明顯的抗凝作用，但隨著劑量的增加，其抗凝作用并未增強(qiáng)。由此可見，烏司他丁劑量敏感性存在性別差異，該差異性可能與烏司他丁是從男性尿液提取的制作的因素有關(guān)。同時(shí)，這種差異性對(duì)臨床上應(yīng)用烏司他丁進(jìn)行個(gè)體化治療具有一定的指導(dǎo)意義。此外，如果按照人均3000 mL有效血容量計(jì)算，本研究采用的每毫升全血容納1000 U、2000 U和4000 U的烏司他丁約相當(dāng)于在體單次300萬、600萬和1200萬的烏司他丁劑量，如果考慮首過效應(yīng)，可能達(dá)到本試驗(yàn)相應(yīng)血藥濃度的劑量更高。這也為臨床專家經(jīng)驗(yàn)性大劑量使用烏司他丁臨床有效，提供了一定的臨床證據(jù)。

綜上所述，通過血栓彈力圖我們觀察到大劑量的烏司他丁有體外抗凝作用，這種抗凝作用體現(xiàn)在抑制凝血因子活性、降低纖維蛋白原及血小板功能，且與劑量與性別相關(guān)。在體內(nèi)的抗凝效果如何，尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。