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    依那西普抗體的活性結(jié)構(gòu)保護(hù)

    2018-09-23 07:33:44房筱李代禧郭柏松楊春生
    上海理工大學(xué)學(xué)報 2018年3期
    關(guān)鍵詞:那西普保護(hù)劑甘露醇

    房筱,李代禧,郭柏松,楊春生

    (1. 上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093;2. 上海東富龍科技股份有限公司,上海 201108)

    依那西普(etanercept),是全人源化腫瘤壞死因子(TNF-α)拮抗劑。它可以特異性地與TNF-α結(jié)合,競爭性阻斷TNF-α與細(xì)胞表面的受體結(jié)合[1],主要用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[2]、強(qiáng)直性脊柱炎[3]、斑塊型銀屑病[4]、銀屑病性關(guān)節(jié)炎[5]、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎[6]以及中毒性表皮壞死松懈癥[7]等疾病。由于該類藥物復(fù)溶后的穩(wěn)定性極差,故通常會加入海藻糖(trehalose,TRE)、蔗糖(sucrose,SUC)、甘露醇(mannitol,MAN)等保護(hù)劑作為輔料[8],以穩(wěn)定抗體蛋白藥物的活性結(jié)構(gòu)。在文獻(xiàn)[9]中選用海藻糖和甘露醇作為保護(hù)劑。雖然海藻糖對依那西普抗體蛋白具有保護(hù)效果,但在實際生產(chǎn)中不可能使用任何單一保護(hù)劑對藥物蛋白進(jìn)行保護(hù),獲得顯著的保護(hù)效果,通常需要考慮使用兩種或者兩種以上的保護(hù)劑來穩(wěn)定蛋白質(zhì)藥物的結(jié)構(gòu)活性[10]。蛋白藥物制備中,有時不免要經(jīng)歷低溫或冷凍干燥過程,在此過程中藥物分子活性結(jié)構(gòu)容易發(fā)生改變,為此經(jīng)常選擇一些活性保護(hù)劑加入藥物中,并研究藥物在溶液中和真空冷凍干燥條件下藥物分子的活性變化。

    潘琦等[11]采用拉伸分子動力學(xué)和傘狀采樣研究了依那西普抗體蛋白的解離過程,通過計算其解離自由能,分析了依那西普抗體蛋白在真空干燥和水溶液環(huán)境下的穩(wěn)定性,但對于其本身結(jié)構(gòu)的變化情況、抗體蛋白與保護(hù)劑之間的相互作用,以及保護(hù)劑的保護(hù)作用機(jī)制并未進(jìn)行深入研究。 而且隨著計算機(jī)運算能力和模擬算法設(shè)計的不斷改進(jìn),分子動力學(xué)方法越來越廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)的研究中[12]。

    為此,本文以熱敏性抗體蛋白依那西普為研究對象,選擇海藻糖、蔗糖和甘露醇為保護(hù)劑,采用分子動力學(xué)模擬方法,對依那西普進(jìn)行單一保護(hù)和復(fù)合保護(hù)研究。研究了在溶液和真空干燥環(huán)境下,保護(hù)劑對依那西普活性結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用與規(guī)律,以及保護(hù)劑的保護(hù)作用機(jī)制,從分子角度闡述保護(hù)劑對生物大分子的保護(hù)作用機(jī)理。

    1 原理與方法

    1.1 原理

    分子間接觸數(shù)表征兩分子之間相互作用的強(qiáng)弱,在本研究中當(dāng)兩個原子間的間距小于0.35 nm時,才認(rèn)為原子間相互接觸,視作一個接觸數(shù)[13]。因此通過計算依那西普與保護(hù)劑以及依那西普與水之間的接觸數(shù),以分別表征依那西普蛋白分子與保護(hù)劑分子和水分子之間作用力的強(qiáng)弱以及依那西普的優(yōu)先作用傾向。接觸數(shù)越大,表明分子間的結(jié)合作用越強(qiáng);反之結(jié)合作用越弱。

    由于這3組體系分子數(shù)不同,含有的原子數(shù)也不同,因此模擬系統(tǒng)中保護(hù)劑和水分子原子總數(shù)差異較大。為了準(zhǔn)確比較依那西普分子與不同保護(hù)劑或水分子結(jié)合作用的相對大小,本研究引用接觸系數(shù)的定義[13],定義依那西普的接觸系數(shù)CTW為

    式中:NT為依那西普與保護(hù)劑的接觸數(shù);NW為依那西普與水分子的原子接觸數(shù);MT為保護(hù)劑分子的總原子數(shù);MW為水分子的總原子數(shù)。CTW數(shù)值越大,表明依那西普與保護(hù)劑分子之間的結(jié)合作用越強(qiáng),且依那西普是優(yōu)先與保護(hù)劑作用的。

    1.2 構(gòu)建模型

    依那西普晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:3AVE)從PDB數(shù)據(jù)庫獲得,獲取地址為http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureId=3ave,具體分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。海藻糖、蔗糖、甘露醇的分子結(jié)構(gòu)分別采用Gaussion 09化學(xué)軟件在B3LYP/6-31G*方法下進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化[14],優(yōu)化后的結(jié)構(gòu)為最終結(jié)構(gòu),如圖2所示。

    圖1 依那西普的三維結(jié)構(gòu)Fig.1 Three-dimensional structure of etanercept

    圖2 海藻糖、蔗糖、甘露醇的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structures of trehalose, sucrose and mannitol

    1.3 模擬方法

    分子動力學(xué)模擬方法采用 Gromacs 5.1.4生物大分子軟件包[15],其中依那西普蛋白選用Amber99sb-ildn力場[16],水分子選用TIP3P模型[17]。在模擬過程中,時間步長設(shè)定為1 fs,范德華相互作用利用Lenard-Jones函數(shù)計算[18],截斷設(shè)為1.0 nm。為了修正范德華分子間的遠(yuǎn)程相互作用,鄰近作用半徑設(shè)為1.0 nm,每10步重建一次鄰 近 列 表 。 采 用 PME( particle mesh Ewald) 方法[19]用于靜電相互作用的遠(yuǎn)程修正,靜電相互作用的截斷設(shè)定為1.0 nm。

    首先,建立 9 nm × 9 nm × 9 nm 的周期性體系,每個體系中分別添加相應(yīng)的保護(hù)劑,添加離子中和體系電荷,共構(gòu)建了3組保護(hù)體系以及1組對照體系,如表1所示。每個體系分別進(jìn)行5 000步 的 能 量 最 小 化 , 再 以 LINCS(linear constraint solver)方法[20]限制所有化學(xué)鍵的鍵長,利用 Maxwell 分布方法[21]設(shè)置體系各原子的初始速度,并通過 Velocity-rescale方法[22]控制體系的溫度為 300 K,耦合常數(shù)為 0.1,同時系統(tǒng)壓力采用 Berendsen方法[23]設(shè)定體系的壓強(qiáng)耦合常數(shù)為0.5。對水溶液體系和真空環(huán)境體系分別進(jìn)行5 ns的預(yù)平衡,再平衡 40 ns,得到均勻穩(wěn)定的依那西普蛋白的水溶液體系和依那西普蛋白的真空環(huán)境體系。

    表1 依那西普4組保護(hù)體系的組成Tab.1 Composition of the four protective systems of etanercept

    體系達(dá)到平衡后,取最后5 ns用于數(shù)據(jù)分析,采用SPSS19.0軟件中的單因素方差分析進(jìn)行計算。對同一環(huán)境條件下,不同保護(hù)體系之間進(jìn)行比較,運用單因素方差分析中的Tukey檢驗程序進(jìn)行,所選取的置信區(qū)間為95%,并采用Origin8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行圖形化處理。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 依那西普的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性分析

    為了判斷分子動力學(xué)模擬過程中體系的穩(wěn)定性,計算了主鏈相對于初始結(jié)構(gòu)的均方根偏差(root mean square deviation, RMSD)。 RMSD 可以反映特定結(jié)構(gòu)與初始結(jié)構(gòu)的相似程度,均方根偏差值RMSD越低,表明特定結(jié)構(gòu)與初始結(jié)構(gòu)的差異性越小[24]。為此,分別計算了水溶液和真空環(huán)境下,依那西普在不同保護(hù)體系中的RMSD,如圖3所示,考察了不同環(huán)境及不同保護(hù)劑配方對抗體蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響。模擬平衡后,最后5 ns的RMSD之間的顯著性(檢測水平p = 0.05),在柱狀圖上用字母表示,字母相同表示無顯著差異,字母不同表示差異顯著。

    圖3 依那西普在真空干燥環(huán)境和水溶液中的RMSDFig.3 RMSD of each etanercept in vacuum drying and aqueous solutions environment

    從圖3可以看出,真空環(huán)境中4種體系的依那西普RMSD比其在溶液中的RMSD低,其中海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系中依那西普的RMSD最低,此種復(fù)合保護(hù)劑對依那西普的穩(wěn)定作用最強(qiáng),與初始結(jié)構(gòu)相比差異性最小。水溶液中4種體系的RMSD均比其各自在真空環(huán)境的RMSD略高,說明依那西普抗體蛋白在水溶液中的穩(wěn)定性小于真空環(huán)境,溶液體系中水分子對蛋白藥物的穩(wěn)定性有一定影響。加入保護(hù)劑后與未添加保護(hù)劑的抗體蛋白相比,其RMSD明顯降低,而且經(jīng)過單因素方差分析后可以看出,具有保護(hù)劑的抗體蛋白的RMSD與未添加保護(hù)劑時相比具有顯著性差異,這說明保護(hù)劑能顯著提高體系中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。在真空干燥環(huán)境中,具有復(fù)合保護(hù)劑的抗體蛋白的RMSD比純海藻糖保護(hù)體系的RMSD低,且具有顯著性差異,但是海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系及蔗糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系中抗體蛋白的RMSD無顯著差異,這說明在依那西普活性保護(hù)過程中,在冷凍干燥條件下,復(fù)合保護(hù)體系能夠更好地保護(hù)抗體蛋白的活性結(jié)構(gòu)。而在水溶液環(huán)境中,海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系的RMSD低于其他3組體系,且經(jīng)過方差分析得出,其RMSD與其他3組相比具有顯著性差異。可見,海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系對依那西普活性結(jié)構(gòu)保護(hù)效果最好。

    為了檢測加入保護(hù)劑后對抗體蛋白原子的影響,計算了抗體蛋白中的主鏈原子的均方根漲落(root mean square fluctuation,RMSF),如圖 4 所示為抗體蛋白主鏈的均方根漲落值RMSF。

    圖4 不同保護(hù)體系中依那西普主鏈的RMSFFig.4 RMSF of the etanercept’s main chain in different protective systems

    由圖4可以得出,海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系中依那西普的RMSF最小,說明該保護(hù)劑與抗體蛋白存在較強(qiáng)的相互作用,能夠提高抗體蛋白的穩(wěn)定性。在溶液體系中,依那西普在無保護(hù)劑的情況下,其RMSF較高,說明在純水溶液中依那西普抗體蛋白中的主鏈漲落幅度較大。而加入保護(hù)劑后,體系中原子漲落幅度有較明顯的降低,說明保護(hù)劑與抗體蛋白之間存在相互作用,從而降低了原子的運動強(qiáng)度,提高了蛋白體系的穩(wěn)定性。加入保護(hù)劑后,抗體蛋白的主鏈漲落幅度相對較小,但還有一定漲落,說明保護(hù)劑并不能完全降低抗體蛋白原子的熱運動,分析其原因為保護(hù)劑并不是完全覆蓋在蛋白表面,不同保護(hù)劑具有選擇吸附性,且吸附區(qū)域不同,導(dǎo)致保護(hù)劑與抗體蛋白之間的相互作用存在強(qiáng)弱分布,如圖5所示。其中,橙色表示海藻糖;黃色表示蔗糖;紫色表示甘露醇。

    圖5 復(fù)合保護(hù)體系在依那西普抗體蛋白表面的吸附情況Fig.5 Adsorption of complex protective system on the surface of etanercept

    圖6 依那西普與保護(hù)劑之間的平均相互作用能Fig. 6 Average interaction energy between etanercept and protectants

    2.2 依那西普保護(hù)體系分子間的相互作用

    依那西普抗體蛋白與保護(hù)劑分子間存在相互作用,通過比較分子間相互作用能以區(qū)分蛋白質(zhì)與保護(hù)劑分子間相互作用力的強(qiáng)弱[25]。依那西普與不同保護(hù)劑之間的平均相互作用能如圖6所示。在水溶液環(huán)境中抗體蛋白與保護(hù)劑之間的相互作用能低于真空干燥環(huán)境,其原因是在水溶液中,保護(hù)劑、蛋白質(zhì)、水三者之間均存在相互作用,保護(hù)劑均具有親水性,水分子與保護(hù)劑之間存在較強(qiáng)的相互作用,降低了保護(hù)劑與抗體蛋白之間的相互作用。在真空干燥環(huán)境中,海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系、蔗糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系的相互作用能與純海藻糖體系相比具有顯著差異,說明單一保護(hù)體系對抗體蛋白的保護(hù)作用是有限的。在水溶液環(huán)境中,海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系與蔗糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系的相互作用能值高于純海藻糖保護(hù)體系,且3種保護(hù)劑體系之間的相互作用能具有顯著差異,這說明復(fù)合保護(hù)劑與抗體蛋白之間有較強(qiáng)的相互作用,其中海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)劑與抗體蛋白的相互作用能較高。而兩種復(fù)合保護(hù)體系之間也具有顯著差異,說明海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)劑與抗體蛋白之間存在較多的分子間相互作用,這種復(fù)合保護(hù)體系更有利于穩(wěn)定抗體蛋白的分子結(jié)構(gòu),這與差示掃描微量熱分析實驗結(jié)果海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系的保護(hù)效果最好是一致的[26]。

    2.3 依那西普保護(hù)體系的分子間氫鍵作用

    圖7為真空干燥環(huán)境與水溶液中依那西普與保護(hù)劑之間的氫鍵數(shù)??梢钥闯?,真空干燥環(huán)境中抗體蛋白與保護(hù)劑之間的氫鍵數(shù)多于在水溶液中的氫鍵數(shù),而在溶液中海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)與抗體蛋白之間存在較強(qiáng)的氫鍵相互作用,穩(wěn)定抗體蛋白分子結(jié)構(gòu)。通過單因素方差分析可以看出,真空干燥環(huán)境中抗體蛋白與保護(hù)劑之間的氫鍵數(shù)明顯多于兩者在溶液中的氫鍵數(shù),由于在真空干燥環(huán)境中保護(hù)劑與依那西普蛋白之間形成了較多的分子間氫鍵,表現(xiàn)出較強(qiáng)的直接相互作用。而在水溶液環(huán)境中,由于大量水的存在,水與抗體蛋白、保護(hù)劑之間均存在分子間作用力,且部分保護(hù)劑與水的相互作用強(qiáng)于保護(hù)劑與抗體蛋白之間的相互作用。由于分子處在不停的運動中,部分保護(hù)劑與抗體蛋白接觸減少,使得保護(hù)劑與依那西普之間形成的分子間氫鍵較少,分子間的相互作用減弱。

    圖7 真空干燥環(huán)境與水溶液中依那西普與保護(hù)劑之間的氫鍵數(shù)Fig.7 Number of hydrogen bonds between etanercept and protectants in vaccum drying and aqueous solution environment

    在水溶液環(huán)境中,通過分析保護(hù)劑與抗體蛋白之間的氫鍵數(shù)的平均值和方差得出,復(fù)合保護(hù)體系中保護(hù)劑與抗體蛋白之間的氫鍵數(shù)多于單一保護(hù)體系兩者之間的數(shù)量,說明復(fù)合保護(hù)劑與抗體蛋白之間形成較多的氫鍵結(jié)合位置,也間接說明復(fù)合保護(hù)劑之間能夠協(xié)同交叉保護(hù)抗體蛋白。而且動力學(xué)和熱力學(xué)研究也表明,復(fù)合保護(hù)體系中保護(hù)劑與依那西普蛋白之間的氫鍵數(shù)目多于單一保護(hù)劑體系[11]。

    由于保護(hù)劑對蛋白藥物的保護(hù)作用主要是通過分子間相互作用實現(xiàn)的,主要推動力是靜電相互作用,同時氫鍵也起到一定的作用[27]。有研究表明,糖類與蛋白質(zhì)之間的氫鍵結(jié)合是抑制蛋白質(zhì)在冷凍干燥過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)變性的主要原因[28],說明在冷凍干燥過程中蛋白質(zhì)與保護(hù)劑之間形成的氫鍵,能夠降低熱振動和穩(wěn)定體系的結(jié)構(gòu),有利于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)保持穩(wěn)定性。通過分析保護(hù)劑與抗體蛋白之間的氫鍵,得出復(fù)合保護(hù)體系中保護(hù)劑與抗體蛋白之間的氫鍵相互作用強(qiáng)于海藻糖單一保護(hù)體系,而海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系對抗體蛋白的氫鍵相互作用最大。

    2.4 依那西普保護(hù)體系的分子間接觸系數(shù)

    圖8為溶液中抗體蛋白與保護(hù)劑之間的接觸系數(shù)。從接觸系數(shù)及方差分析中可以看出,復(fù)合保護(hù)體系的接觸系數(shù)遠(yuǎn)大于單一保護(hù)體系,且海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系的接觸系數(shù)最大,為6.63。所以在溶液中復(fù)合保護(hù)體系中保護(hù)劑與蛋白質(zhì)有較多的分子間接觸,在溶液中抗體蛋白不僅與保護(hù)劑之間存在分子間接觸,而且還與水之間存在較多的接觸,計算得出它們之間的接觸系數(shù)均大于1,說明在溶液中依那西普更易于與保護(hù)劑之間產(chǎn)生分子間接觸。在3種保護(hù)體系中,海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)劑與抗體蛋白之間的接觸能力更強(qiáng),與抗體蛋白分子間產(chǎn)生的分子間結(jié)合作用也是最強(qiáng)。

    圖8 依那西普與保護(hù)劑之間的接觸系數(shù)Fig.8 Number of contact coefficient between etanercept and protectants

    3 結(jié) 論

    通過分析海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系、蔗糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系、純海藻糖體系中保護(hù)劑與蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系,并與不添加保護(hù)劑的體系相比,可以看出這3種保護(hù)體系對依那西普抗體蛋白均具有保護(hù)作用。其中,海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系與蔗糖–甘露醇體系對抗體蛋白結(jié)構(gòu)活性的穩(wěn)定作用強(qiáng)于純海藻糖保護(hù)體系,而海藻糖–甘露醇復(fù)合保護(hù)體系的對抗體蛋白保護(hù)作用更強(qiáng)。本文從分子水平上闡述了保護(hù)劑對抗體蛋白的保護(hù)作用機(jī)理,這不僅篩選出依那西普抗體蛋白的最適保護(hù)劑,而且還從理論上解釋了其活性保護(hù)作用規(guī)律。分子模擬方法與實驗篩選相比,不僅節(jié)省了大量的篩選時間、研究成本,而且能從理論上闡釋篩選出的保護(hù)劑對蛋白質(zhì)的保護(hù)效果及作用機(jī)理,特別是針對大通量篩選最適保護(hù)劑,此種方法更能節(jié)約成本。隨著分子動力學(xué)模擬方法不斷發(fā)展,如模擬算法、分子力場的發(fā)展、模擬技術(shù)與分子數(shù)據(jù)庫相結(jié)合,相信以后此方法在諸多領(lǐng)域中會起到越來越重要的作用。

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