HPLC法測定特殊醫(yī)學用途嬰配食品中的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的研究

李濤，周艷華，孫桂芳，楊滔，楊慶懿

(1.湖南省食品質量監(jiān)督檢驗研究院長沙 410111；2.長沙環(huán)境保護職業(yè)技術學院長沙 410004）

0 引 言

特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品（以下簡稱特醫(yī)嬰配食品）是部分患病嬰兒生命早期或出生后相當長時間內(nèi)賴以生存的唯一或主要食物來源，《食品安全國家標準特殊醫(yī)學用途嬰兒配方食品通則》對各項營養(yǎng)指標進行規(guī)定[1-2]。維生素E又名生育酚，具有多種異構體，具有消除體內(nèi)自由基、促進血液循環(huán)等多種生理功能，自然界分布最廣泛和含量最高的是α-生育酚[3]。α-生育酚醋酸酯是由α-生育酚的酚羥基乙?；玫?，不易受空氣、光、紫外線的作用氧化，具有更好的穩(wěn)定性和藥理功效[4]。維生素E是特醫(yī)嬰配食品中一項重要的營養(yǎng)指標，對于嬰兒尤其是新生兒、早產(chǎn)兒的生長發(fā)育過程有著重要的影響，添加形式為α-生育酚及α-生育酚醋酸酯[5-7]。目前，現(xiàn)有維生素E測定主要有液相法和液相色譜串聯(lián)質譜法，現(xiàn)有食品安全國家標準中維生素E測定是一般需對樣品進行酶解、皂化、提取、分離、濃縮等步驟，操作極其繁瑣耗時[8-10]。特醫(yī)嬰配食品中維生素E的檢測未見報道，特醫(yī)嬰配食品有6種配方，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)依照現(xiàn)有標準中皂化條件進行皂化，會出現(xiàn)皂化不完全、嚴重乳化、維生素E結果偏低等現(xiàn)象，且α-生育酚不穩(wěn)定，在此分析過程中易損耗，回收率不高，不能進行批量操作。此試驗采用正向高效液相色譜直接測定特殊醫(yī)學用途配方食品中的α-生育酚和α-生育酚醋酸酯[11]。此檢驗方法能準確測定產(chǎn)品中α-生育酚營養(yǎng)強化類別及含量，指導特醫(yī)生產(chǎn)企業(yè)對產(chǎn)品的質量控制，也為特醫(yī)嬰配食品中維生素E檢測提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

特醫(yī)無乳糖配方奶粉（A）、特醫(yī)乳蛋白部分水解配方奶粉（B）、特醫(yī)乳蛋白深度水解配方奶粉（C1）/氨基酸配方奶粉（C2）、特醫(yī)早產(chǎn)/低出生體重嬰兒配方乳(D)、特醫(yī)母乳營養(yǎng)補充劑（E）、特醫(yī)氨基酸代謝障礙配方乳（F）來源于雅培等企業(yè)。

標準品：純度96.0%DL-α-生育酚（上海安譜）；純度98.4%DL-α-生育酚醋酸酯，（Dr.E）；異丙醇、叔丁基甲醚、正己烷、甲醇、無水乙醇、異辛烷、均為色譜純（上海安譜）；對苯二酚、冰醋酸、無水乙酸鈉、鹽酸，均為分析純（上海安譜）；木瓜蛋白酶＞400 U/mg，（BoMei0696）。

1.1.2 主要儀器設備

LC-20A高效液相色譜儀(帶DAD檢測器，日本島津公司)，HMS-350漩渦振蕩器（上海珂淮儀器有限公司），BS224S電子分析天平（德國賽多利斯公司），X 1R臺式冷凍離心機（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），PB-10 pH酸度計（德國賽多利斯公司），HWS-28電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的制備

分別稱取α-生育酚醋酸酯和α-生育酚約25 mg（準確至0.1 mg)至25 mL容量瓶中，異辛烷溶解并定容至刻度。分別精取1.0 mL標準溶液至10 mL容量瓶中，異辛烷稀釋至刻度，得100.0μg/mL混標儲備液，分別精取0.05、0.10、0.20、0.50、1.0、2.0、4.0 mL混標儲備液至10 mL容量瓶中，異辛烷稀釋至刻度，得濃度為0.5～40.0μg/mL的標準使用液。

1.2.2 供試品溶液的制備

（1）樣品稱量固體樣品混勻后精確稱重0.5 g至50 mL離心管；液態(tài)樣品精確稱取5.0 g至50 mL離心管中。

（2）酶解800 U/mL木瓜蛋白酶溶液：稱取250 mg對苯二酚和10.0 g無水醋酸鈉于250 mL容量瓶中，加水200 mL溶解，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，加入0.5 g木瓜蛋白酶超聲5 min，冷卻后定容至刻度。向樣品溶液中加入5.0 mL木瓜蛋白酶溶液，混勻后置于37±2℃水浴30 min后冷卻。

（3）提取向酶解液中加入20.0 mL 2%醋酸甲醇，振蕩15 min，精密加入10.0 mL異辛烷振蕩提取15 min，5 000 r/min離心機中離心10 min，取異辛烷層用于高效液相色譜分析。

1.2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax NH2（4.6 mm×150 mm×5 μm）；流動相A為正己烷，流動相B為25%叔丁基甲醚正己烷，流動相梯度洗脫程序詳見表1；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：50μL；熒光檢測器的激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為310 nm。

表1 梯度洗脫程序

2 結果與分析

2.1 線性關系考察

取標準使用液注入液相色譜儀測定，以峰面積（Y）為縱坐標，進樣濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，見圖1和圖2。α-生育酚醋酸酯線性方程為：Y=266 153.35X+2 760.08(R2=0.999 9)，α-生育酚線性方程為 Y=1 552 209.8X-89 555.89(R2=0.999 5)，標準工作液濃度在0.5～40.0μg/mL范圍內(nèi)，校準曲線線性良好。

圖1 α-生育酚醋酸酯標準曲線圖

圖2 α-生育酚標準曲線圖

2.2 檢出限和定量限

取空白響應值的2～3倍對應濃度的混合標準溶液0.5μg/mL，平行測定11次，根據(jù)檢出限的計算方法LOD=3sd/b和LOQ=10sd/b(sd為標準偏差，b為工作曲線斜率)，當取樣量為0.5 g，異辛烷提取體積為10.0 mL時，方法檢出限和定量限見表2。此方法的檢出限與定量限低于GB 5009.82-2016，說明此檢驗方法具有更高的靈敏度。

2.3 樣品含量測定和精密度試驗

特醫(yī)嬰配食品A-F分別平行取樣6組，按供試品溶液制備方法制備，進液相色譜測定，特醫(yī)嬰配食品A-F號中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚含量及精密度結果見表3和表4。結果顯示6種特醫(yī)嬰配食品配方中均添加α生育酚醋酸酯和α-生育酚，且添加量依據(jù)適用對象的差異而不同，母乳營養(yǎng)補充劑中α-生育酚醋酸酯含量最高，氨基酸配方中α-生育酚含量最高；各配方中α-生育酚醋酸酯含量為0.37～69.0 mg/100g，精密度為0.6%～9.9%，α-生育酚含量為0.16～8.4 mg/100g，精密度在1.3%～7.2%之間，精密度均滿足測定要求。

表2 檢出限和定量限

表3 特醫(yī)嬰配食品中α-生育酚醋酸酯含量及精密度

表4 特醫(yī)嬰配食品中α生育酚含量及精密度

2.4 加標回收率試驗

選取深度水解配方奶粉（C1）為代表進行特醫(yī)嬰配食品回收率試驗，共9份，每個濃度3份，分別添加12.0μg、24.0μg、40.0μg的混合標準溶液，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，進液相色譜測定。α-生育酚醋酸酯和α-生育酚加標回收率見表5。由表5可知，α-生育酚醋酸酯在不同添加濃度下回收率在80.2%～91.1%之間，RSD值為0.7%～5.4%，α-生育酚在不同添加濃度下回收率在80.4%～94.8%之間，RSD值為1.8%～5.8%之間，深度水解配方奶粉為特醫(yī)嬰配奶粉中最復雜基質之一，說明該方法對特醫(yī)嬰配食品中不同濃度α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的測定具有較高的準確度。

表5 樣品加標回收率

2.5 檢驗方法的選擇性

圖3和圖4分別為混合標準溶液和7種特醫(yī)嬰配食品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的圖譜，α-生育酚醋酸酯保留時間為4.7 min，α-生育酚保留時間為12.1 min，樣品長時間測定過程中α-生育酚醋酸酯保留時間會發(fā)生一定變化，因此測定過程中需添加標準溶液進行定性。特醫(yī)嬰配食品成分及其復雜，但應用熒光檢測器進行檢測，由圖4可知，未發(fā)現(xiàn)基質干擾，表明該檢驗方法對特醫(yī)嬰配食品中中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚具有良好選擇性，分離度高。

圖3 標準溶液中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚

3 結論

試驗建立正相液相色譜測定特醫(yī)嬰配食品中的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚的測定方法。采用木瓜蛋白酶酶解蛋白質，游離包裹的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚，酸化甲醇沉淀蛋白質類物質，異辛烷提取，氨基柱正相分離，熒光檢測。在0.5～40.0μg/mL范圍內(nèi)呈線性相關，α-生育酚醋酸酯和α-生育酚檢出限分別為5.6μg/100g和6.9μg/100g，不同添加濃度回收率為80.2%～94.8%。

圖4 特醫(yī)嬰配食品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚

維生素E活性用α-生育酚當量（α-TE）表示，1 mgα-TE=1 mg d-α-生育酚，用此檢驗方法檢驗特醫(yī)嬰配食品中維生素E（α-TE）含量時需折算，1 mg dl-α-生育酚=0.74 mg d-α-生育酚，1 mg dl-α-生育酚醋酸酯=0.67 mg d-α-生育酚，此檢驗方法的線性范圍和檢出限均優(yōu)于現(xiàn)有食品安全國家標準GB 5009.82-2016。前期試驗研究表明現(xiàn)有國標測定特醫(yī)嬰配食品中α-生育酚時，多種配方產(chǎn)品皂化時會出現(xiàn)乳化現(xiàn)象嚴重、皂化不完全和精密差等問題。本試驗方法采用直接測定樣品中α-生育酚醋酸酯和α-生育酚，避開操作繁雜的皂化過程，操作簡單，精密度和準確度高，可實現(xiàn)批量檢測。此試驗建立的檢測方法簡單、快速、準確，針對特醫(yī)嬰配產(chǎn)品中的α-生育酚醋酸酯和α-生育酚檢測重復性好，為特殊醫(yī)學用途食品生產(chǎn)廠家進行質量控制提供指導，也為檢測特醫(yī)嬰配食品中維生素E提供技術參考。