含乳食品中動(dòng)物水解蛋白L-羥脯氨酸的檢測(cè)

郭有輝，楊艷秋，胡露，唐懋，王麗娜，葉梅

（成都市食品藥品檢驗(yàn)研究院，成都 610100）

0 引 言

隨著國民生活質(zhì)量的提高，食品安全問題日益受到全社會(huì)廣泛關(guān)注。動(dòng)物水解蛋白是以動(dòng)物皮革中的膠原蛋白為原料，水解精制而成的產(chǎn)物，此類物質(zhì)加入到食品中會(huì)帶來潛在的危害。在乳及乳制品中添加動(dòng)物水解蛋白的主要目的是為了降低成本，以提高產(chǎn)品含氮量，追求利潤(rùn)而添加。因此，區(qū)分乳蛋白和動(dòng)物水解蛋白顯得尤為重要。

目前用于測(cè)定動(dòng)物水解蛋白L-羥脯氨酸的方法主要有分光光度法和高效液相色譜法，但這兩種方法操作繁雜，水解時(shí)間過長(zhǎng)，不適合大批量樣品的分析。

本實(shí)驗(yàn)參考了相關(guān)文獻(xiàn)[4-8]。對(duì)試樣中羥脯氨酸的水解方法進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，通過改進(jìn)的硫酸溶液烘箱恒溫水解法縮短了分析時(shí)間，操作安全簡(jiǎn)單，并且適用于大批量實(shí)驗(yàn)操作。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

乳粉、乳飲料、滅菌乳、豬皮膠原蛋白粉（市售）。

1.2 試劑

硫酸，氫氧化鈉，檸檬酸，結(jié)晶乙酸鈉，正丙醇，氯胺T，對(duì)二甲氨基苯甲醛，高氯酸，L(-)-羥脯氨酸（Aifa Aesar)。本研究所用試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 儀器

紫外可見分光光度計(jì)，酸度計(jì)，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.4 方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)原理

試樣經(jīng)硫酸于120℃水解釋放出L(-)-羥脯氨酸，經(jīng)氯胺T氧化、生成含有吡咯環(huán)的氧化物，用高氯酸破壞過量的氯胺T，L(-)-羥氨酸氧化物與對(duì)二氨基苯甲醛反應(yīng)生成紅色化合物，在558 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線系列比較定量。

1.4.2 試劑配制

硫酸溶液（6 mol/L）：量取約500 mL于1 L容量瓶中,在攪拌下緩慢加入320 mL濃硫酸(ρ=1.84 g/mL),冷卻后用水定容；

緩沖溶液(pH值為6.8)：分別準(zhǔn)確稱取26.0 g一水檸檬酸，14.0 g氫氧化鈉，78.0 g三水乙酸鈉，用500 mL水溶解上述試劑并轉(zhuǎn)入1 L的容量瓶中，加入250 mL的正丙醇，用水定容；

氯胺T：準(zhǔn)確稱取1.41 g三水·N－氯－對(duì)甲苯磺酰胺鈉鹽(氯胺T)，加入100 mL緩沖溶液溶解，臨用前配置；

顯色劑：稱取10.0 g對(duì)二甲基苯甲醛，用35 mL高氯酸溶液（60%）溶解，緩慢加入65 mL異丙醇，臨用前配置；

羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取50 mg 4－羥基－α－吡咯甲酸(羥脯氨酸)于100 mL容量瓶，用水溶解加入一滴硫酸溶液，用水定容，此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為500μg/mL；

氫氧化鈉溶液（濃度10 mol/L，1 mol/L）；

羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液5.0μg/mL：吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.00 mL于500 mL容量瓶中定容。

1.4.3 樣品前處理

稱取液體樣品5.0 g（固體樣品1.0 g加水至5.0 g左右)至100 mL具塞比色管或具塞三角瓶中，加入25 mL濃度為6 mol/L的硫酸溶液，蓋上塞子，放入恒溫干燥箱中，120℃恒溫水解4 h。趁熱將水解產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，用10 mL硫酸容液分三次洗滌具塞比色管或具塞三角瓶，合并洗液至上述容量瓶中。用水定容，搖勻，所得濾液為樣品水解液。

吸取25.0 mL水解液于100 mL燒杯中,用濃度為10 mol/L和1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8±0.2，過濾于100 mL容量瓶中，用水沖洗燒杯和濾紙上的氫氧化亞錫沉淀，反復(fù)3次，把洗液并入濾液中，以水洗到刻度，搖勻備用。同時(shí)做空白試驗(yàn)。

1.4.4 試樣測(cè)定

吸取 L(-)-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液 0.00，10.00，20.00，30.00，40.00，50.00 mL；分別置于100 mL容量瓶中，搖勻定容。標(biāo)液質(zhì)量濃度分別為0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5μg/mL。分別準(zhǔn)確吸取4.0 mL制備好的濾液和不同質(zhì)量濃度的L(-)-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液于25 mL具塞比色管中，加氯胺T溶液2.0 mL，搖勻后于室溫放置20 min。加入顯色劑2.0 mL，充分混勻后，迅速將比色管放于入60℃恒溫水浴中保溫20 min后取出，流水浴迅速冷卻比色管，在波長(zhǎng)558 nm處測(cè)定吸光值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品以扣除了空白溶液的吸光值，從所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線查找對(duì)應(yīng)的濃度，然后計(jì)算出樣品中羥脯氨酸的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

本方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線以扣除試劑空白的標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=0.208X+0.000，R2=0.999。由圖1可以看出，表明標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的吸光度Abs和羥脯氨酸的濃度之間存在很好的相關(guān)性。

2.2 實(shí)驗(yàn)水解條件選擇

3個(gè)摻加3%，5%，10%豬皮膠原蛋白粉的乳粉樣品各26組分別采用濃度為3 mol/L和6 mol/L的硫酸溶液在120℃恒溫烘箱中水解樣品，水解不同時(shí)間測(cè)得的羥脯氨酸質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果如表1所示；采用濃度為6 mol/L的硫酸溶液在不同溫度的恒溫烘箱中水解樣品4 h測(cè)得羥脯氨酸的質(zhì)量濃度檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

圖1 L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

表1 不同水解時(shí)間測(cè)得羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果 mg/g

表2 不同溫度下水解樣品測(cè)得羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)結(jié)果 mg/g

結(jié)果表明，使用3 mol/L硫酸溶液水解樣品，樣品A使用3 mol/L硫酸溶液水解在6 h后測(cè)得的羥脯氨酸質(zhì)量濃度變化不大，樣品B、C使用3 mol/L硫酸溶液水解在8 h也不能判定是否水解完全，而使用6 mol/L硫酸溶液水解時(shí)間超過4h三個(gè)樣品測(cè)得的羥脯氨酸質(zhì)量濃度變化不大，水解反應(yīng)完全 。使用6 mol/L硫酸溶液在不同溫度下水解樣品4 h測(cè)定結(jié)果表明，樣品在120℃水解后測(cè)定結(jié)果基本趨于穩(wěn)定，水解反應(yīng)完全。依據(jù)表1、表2的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，及考慮方法適用的寬泛性（滿足不同羥脯氨酸含量的樣品），樣品水解的硫酸溶液濃度選用6 mol/L，而水解時(shí)間選為4 h，水解溫度選為120℃。

2.3 試樣水解方法的改進(jìn)優(yōu)化

目前國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室通常采用的由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院提供的“乳與乳制品中動(dòng)物水解蛋白鑒定—L（-）-羥脯氨酸含量的測(cè)定”文獻(xiàn)方法。但是該方法中提供的兩種試樣處理方法均有不盡人意的地方，方法分析時(shí)間長(zhǎng)、操作繁瑣、不適合批量操作。本方法對(duì)試樣的水解方法進(jìn)行了改進(jìn)優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)采用硫酸溶液代替鹽酸溶液水解。因?yàn)辂}酸易揮發(fā)，所以其水解的時(shí)候必須用水浴加熱冷凝回流裝置，而水浴加熱不適用于大批量操作，而硫酸溶液不易揮發(fā)所以采用烘箱恒溫替代水浴加熱回流，同時(shí)將烘箱的溫度提升到120℃，恒溫水解時(shí)間縮短到4 h。

2.4 檢測(cè)方法比較

取乳粉、乳飲料、滅菌乳及摻加3%，5%，10%豬皮膠原蛋白粉的乳粉樣品。分別采用本方法與中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院提供的文獻(xiàn)方法[2]及肉制品國標(biāo)法[1]三種檢測(cè)方法同時(shí)進(jìn)行L-羥脯氨酸測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表3。

表3 3種檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果比較 mg/g

由表3可以看出，未摻加豬皮膠原蛋白粉的乳粉，乳飲料，滅菌乳樣品三種檢測(cè)方法均未檢出，結(jié)果一致。摻加豬皮膠原蛋白粉的樣品三種檢測(cè)方法測(cè)定結(jié)果基本一致，相對(duì)偏差都小于10%。乳粉中羥脯氨酸質(zhì)量濃度與膠原水解蛋白的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)，羥脯氨酸質(zhì)量濃度變化可以反映乳粉中摻加的豬皮膠原水解蛋白粉的情況。文獻(xiàn)[2]中報(bào)道羥脯氨酸約占膠原蛋白氨基酸總量的10%左右，本實(shí)驗(yàn)中實(shí)際摻加的豬皮膠原水解蛋白粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%，5%，10%；經(jīng)本實(shí)驗(yàn)測(cè)得羥脯氨酸的質(zhì)量濃度換算，得到該豬皮膠原蛋白粉的羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.2%，11.0%，10.5%；與文獻(xiàn)[2]中報(bào)道吻合。實(shí)驗(yàn)表明本方法適用于含乳食品中L(-)-羥脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定。

2.5 方法測(cè)定低限

控制相同的實(shí)驗(yàn)條件，以消除系統(tǒng)誤差的空白樣品作為測(cè)定對(duì)象，進(jìn)行重復(fù)測(cè)定20次，得到空白的吸光度。同樣的實(shí)驗(yàn)條件下以5μg/g標(biāo)準(zhǔn)樣品作為測(cè)定對(duì)象，重復(fù)測(cè)定得到標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度。通過計(jì)算得到方法的測(cè)定低限為50μg/g。

2.6 方法準(zhǔn)確度的實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確度采用加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，稱取1.0 g混合均勻后的乳粉樣品，加入方法測(cè)定低限(50μg)、兩倍方法測(cè)定低限(100μg)、十倍方法測(cè)定低限(500μg)的L-羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，然后按本方法1.4進(jìn)行處理后測(cè)定，其樣品加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果 μg

實(shí)驗(yàn)表明樣品加標(biāo)回收率為92.4%～96.2%，滿足GB/T 27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)附錄F檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求[3]，表明本實(shí)驗(yàn)完全滿足檢測(cè)方法確認(rèn)的準(zhǔn)確度要求。

2.7 方法精密度實(shí)驗(yàn)

按試驗(yàn)方法，平行測(cè)定3個(gè)加入羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的乳粉樣品重復(fù)測(cè)定10次。對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差S和變異系數(shù)CV%，考察該方法的精密度，結(jié)果如表5所示。

表5 精密度實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 μg

由表5可以看出，本方法測(cè)定羥脯氨酸的標(biāo)準(zhǔn)偏差S為0.75～4.03，變異系數(shù)CV為1.6%～2.5%，方法精密度較高。滿足GB/T 27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)附錄F檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求[3]，表明本研究完全滿足檢測(cè)方法確認(rèn)的精密度要求。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了快速、準(zhǔn)確測(cè)定含乳食品中動(dòng)物水解蛋白L-羥脯氨酸的檢測(cè)方法。方法測(cè)得的回收率在92.4%～98.2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為3.95%。本研究方法準(zhǔn)確度，精密度均滿足GB/T 27404-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)附錄F檢測(cè)方法確認(rèn)的技術(shù)要求。結(jié)果表明，方法操作簡(jiǎn)單安全、準(zhǔn)確度高、精密度好、縮短了檢測(cè)周期，可大批量操作。解決了通常實(shí)驗(yàn)室采用方法中的批量操作不適用以及分析時(shí)間過長(zhǎng)的問題。方法能夠滿足含乳食品中的動(dòng)物水解蛋白L（-）-羥脯氨酸含量的測(cè)定，以判定食品中是否添加了動(dòng)物水解蛋白，為食品安全提供保證。