利拉魯肽對大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的影響

李丹丹，張 穎，陳韻岱

冠心病心肌梗死已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人類健康的頭號殺手，直接PCI術(shù)是目前心血管內(nèi)科推薦的最為重要的有效治療手段[1]。但是，在臨床實踐中發(fā)現(xiàn)，在解除機(jī)械性梗阻恢復(fù)血流供應(yīng)后，其末端血流供應(yīng)的心肌組織并沒有完全有效的血流灌注，即出現(xiàn)無復(fù)流現(xiàn)象(no reflow)[2, 3]。無復(fù)流的發(fā)生減少了血運重建帶給患者心功能恢復(fù)的益處，使得住院死亡和再發(fā)心肌梗死的概率增加4～10倍，是影響患者即刻和長期預(yù)后的重要因素[4-8]。無復(fù)流是指在開通梗死相關(guān)動脈時，微循環(huán)血流阻力增大而導(dǎo)致的微循環(huán)灌注不良的現(xiàn)象[3]。再灌注時期大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)的生成被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生IR損傷的重要啟動因素[9-11]。內(nèi)皮細(xì)胞，尤其是冠脈末梢的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMEC)，作為血液和組織之間最重要的屏障，在缺血再灌注損傷中是最先被累及的，是組織缺血再灌注后產(chǎn)生ROS的重要來源。內(nèi)皮細(xì)胞中ROS的生成有多種來源，其主要的來源是NADPH氧化酶、黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)、線粒體呼吸鏈、單核巨噬細(xì)胞來源等[12]。在多項研究中發(fā)現(xiàn)，XO在肝臟內(nèi)皮細(xì)胞、肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞以及CMEC中有較高的表達(dá)量[13]。并且，XO介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷以及細(xì)胞凋亡在再灌注損傷中可能發(fā)揮重要作用[14]。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種由腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的腸促胰島素[15-17]。近年的基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，Liraglutide除降糖作用以外，還具心血管保護(hù)作用，可減少心臟血管炎性反應(yīng)、心肌缺血再灌注損傷、減少心肌梗死面積、抑制心肌細(xì)胞凋亡等[18-20]。本研究通過提取并體外培養(yǎng)SD乳鼠的CMEC，在H/R模型條件下，模擬細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過程，予以Liraglutide預(yù)處理12 h對CMEC進(jìn)行干預(yù)，探究藥物的保護(hù)作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 主要藥品與試劑 Liraglutide、MTT試劑、Hoechst 33342染料購買于美國, Sigma公司； DCFHDA-ROS探針、DHE-ROS探針、丙二醛脂質(zhì)過氧化物檢測試劑盒、GSH檢測試劑盒、超氧化物歧化酶檢測試劑盒均購于北京碧云天公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒(BD Biosciences, 美國)；caspase-3(1∶1000, Cell Signaling Technology), Bcl2 (1∶2000, Abcam), Bax (1∶2000, Abcam), and XO (1∶1000, Abcam)； CD31抗體(Bioss Inc. 中國)；GLP-1R抗體(Bioss Inc. 中國)。5～6 d、質(zhì)量為12～16 g的SD乳鼠(雌雄不限)，購自解放軍總醫(yī)院動物室，該研究中動物、細(xì)胞來源，符合國家《實驗動物管理條例》及解放軍總醫(yī)院倫理準(zhǔn)則。

1.2 方法

1.2.1 CMEC的提取和培養(yǎng) 參照Nishida等[21]雙酶消化分離原代細(xì)胞，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了改良。簡述如下：5只乳鼠處死后取出左心室， 75%乙醇中浸泡15 s，PBS清洗3遍后剪碎組織塊，0.2%Ⅰ型膠原酶37 ℃水浴持續(xù)震蕩攪拌消化10 min，觀察待組織塊明顯變小后，加入0.25%胰蛋白酶37 ℃水浴繼續(xù)消化3 min，隨即終止消化，200目濾網(wǎng)濾過消化后的液體，1000 r/min,7 min離心分離細(xì)胞和多余的培養(yǎng)液，離心完成后棄掉上清液，以1×105/ml的密度緩慢吹打細(xì)胞后， 37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞4 h，去除懸浮未貼壁的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后第一次換液，待細(xì)胞至80%融合生長后，0.25%胰蛋白酶消化傳代。根據(jù)實驗需要使用第一或第二代細(xì)胞。CD31抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定CMEC純度。缺氧4 h加復(fù)氧4 h，誘導(dǎo)CMEC凋亡模型。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測 模型建立成功后，細(xì)胞誘導(dǎo)完成時，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，隨后吹打重懸至200 μl的Annexin V-FITC緩沖液中，再加入5 μl的Annexin V-FITC溶液進(jìn)行37 ℃孵育(避光條件下30 min)，最后再加入10 μl 的PI與上述液體共同避光條件下孵育5 min，結(jié)束后立即對細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)定量分析。

1.2.3 ROS檢測 ROS探針作為檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的方法，細(xì)胞模型建立完成后，更換為正常培養(yǎng)液，將10 μM的DHE加入培養(yǎng)體系中，隨后在37 ℃黑暗中處理30 min，DAPI染核3 min，隨后進(jìn)行常規(guī)PBS洗滌共3次，后用共聚焦顯微鏡觀察胞內(nèi)ROS含量變化。在進(jìn)行ROS定量檢測時，使用流式細(xì)胞學(xué)方法檢測。

1.2.4 MDA、GSH、SOD、GPx檢測 酶標(biāo)儀分析GSH、SOD、MDA、GPx的含量變化，按試劑盒說明書操作。首先將處理的細(xì)胞收集后進(jìn)行離心沉淀，破膜后收集細(xì)胞蛋白進(jìn)行ELISA檢測。預(yù)先繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量曲線，然后按照說明書進(jìn)行ELISA雙夾心法檢測，根據(jù)酶標(biāo)儀測定的吸光值計算最終的蛋白含量及蛋白活性。

1.2.5 免疫熒光染色 細(xì)胞處理完成后，棄掉培養(yǎng)液并使用PBS清洗3遍，4%冰甲醛常溫固定10 min，0.5% Triton X-100通透細(xì)胞膜5 min，山羊血清10%室溫封閉細(xì)胞特異性抗原1 h， 一抗孵育(1∶250) 4 ℃過夜。PBS漂洗3次后加二抗(1∶2000)，室溫避光孵育2 h。滴加DAPI，孵育5 min，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 干擾RNAi 本實驗中針對XO蛋白進(jìn)行抑制表達(dá)實驗。siRNA的設(shè)計由上海吉瑪公司完成，序列如下：siRNA: 5′-CCACCUCCAAGAUUCAUAUTT-3; Anti-sense: 5-CCGAGAAUGAGCCUGAUUU-3, 陰性對照組的序列如下：siRNActrl: 5-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3; Anti-sense:5-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3。

1.2.7 Western blot檢測 各組處理結(jié)束后，提取總蛋白。10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，PVDF膜濕轉(zhuǎn)后山羊血清室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜后使用HRP 標(biāo)記的相應(yīng)二抗(1∶3000)室溫反應(yīng)60 min，暗室曝光，以β-actin作為內(nèi)參。采用Quantity One軟件采集信號和灰度掃描。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 原代CMEC的培養(yǎng)與鑒定 培養(yǎng)的CMECs呈梭形，形似鵝卵石，貼壁培養(yǎng)24 h后開始生長(圖1A)，72～96 h細(xì)胞長滿瓶底，呈典型CMEC的鋪路石樣結(jié)構(gòu)(圖1B)。使用免疫熒光技術(shù)對CMECs表面標(biāo)記分子CD31(圖1C)與Ⅷ(圖1D)因子進(jìn)行鑒定,提示分離的CMEC沒有被心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞污染，純度較高，可以供下一步實驗使用。

圖1 原代CMEC的培養(yǎng)與鑒定

A-B.CMEC接種后24 h和72 h的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察;C-D. CMEC表面標(biāo)記物CD31和VIII因子的免疫熒光鑒定

2.2 CMEC上GLP-1R的表達(dá)情況 于倒置熒光顯微鏡下觀察， CD31單克隆抗體與GLP-1R多克隆抗體進(jìn)行共定位染色，細(xì)胞內(nèi)分別呈綠色和紅色熒光，融合后提示雙陽性率>95%(圖2)。

2.3 不同濃度Liraglutide對細(xì)胞增殖能力的影響 同一時間點上OD值隨Liraglutide藥物濃度增加而顯著升高，于100 nM組達(dá)到最高促生長濃度(P<0.05)。不同時間點上，總體趨勢提示細(xì)胞于藥物干預(yù)24 h后出現(xiàn)對數(shù)生長期，于84 h后進(jìn)入生長平臺期(圖3)。12 h細(xì)胞密度無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，因此將藥物預(yù)處理12 h作為后續(xù)實驗的干預(yù)條件。

圖2 CMEC上GLP-1R的表達(dá)情況

A.CD31單克隆抗體定位染色;B.GLP-1R多克隆抗體定位染色;C.融合后

圖3 不同濃度Liraglutide對細(xì)胞增殖能力的影響

2.4 Liraglutide降低H/R模型下的CMEC凋亡 與正常對照組細(xì)胞相比，H/R模型導(dǎo)致早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/PI-)數(shù)量顯著提高至20.66%±1.30%(P<0.05)(圖4A)。而Liraglutide可以顯著降低早期細(xì)胞凋亡的數(shù)量，并且呈現(xiàn)濃度依賴性(Liraglutide 1 nM 17.38%±0.82%; 10 nM 12.49%±1.02%; 100 nM 8.36% ±1.19%;P<0.05vsH/R)。同時發(fā)現(xiàn)100 nM Liraglutide對于細(xì)胞的保護(hù)作用是最強(qiáng)的，因此后續(xù)實驗選用100 nM預(yù)處理12 h作為干預(yù)條件。同時，H/R組細(xì)胞內(nèi)的ROS顯著上升，而Liraglutide干預(yù)后可以顯著降低胞漿內(nèi)ROS含量(圖4B)。缺氧后給予H2O2可以顯著提高胞漿內(nèi)的ROS，同時伴隨著凋亡蛋白caspase3、Bax等蛋白的顯著增加；而使用ROS清除劑NAC作為陰性對照，一方面中和了過度的ROS，另一方面也顯著降低了凋亡蛋白的含量(圖5)。此外，在H/R模型下，SOD、GSH和GPx的含量顯著下降而MDA在胞漿內(nèi)大量聚集，而Liraglutide干預(yù)后可以顯著上升上述抗氧化因子SOD、GSH和GPx，同時表現(xiàn)為下降的MDA含量(圖6)。

圖4 Liraglutide對H/R模型下的CMEC凋亡率的影響

圖5 Western Blot檢測各組間凋亡蛋白和保護(hù)性蛋白表達(dá)的差異

圖6 H/R模型以及Liraglutide預(yù)處理對細(xì)胞MDA、GPX、SOD、GSH含量的影響

2.5 Liraglutide通過抑制XO-ROS，最終減少線粒體凋亡通路激活 在H/R模型條件下，XO的含量mRNA和蛋白水平均有顯著升高(圖7A-B)。使用siRNA敲低XO，可以顯著減少H/R模型下ROS的產(chǎn)生(圖7C-D)。同時，過度的XO生成會伴隨著caspase3表達(dá)的明顯提高，敲低XO則會顯著減少caspase3的生成。使用Liraglutide預(yù)處理，XO的mRNA水平和蛋白水平均有顯著降低。同時，敲低XO可以進(jìn)一步降低胞漿內(nèi)caspase3的表達(dá)(圖8)。

圖7 Liraglutide對XO-ROS的影響

A-B. PCR和Western Blot檢測各組間XO表達(dá)量的不同；C-D. 流式細(xì)胞學(xué)定量檢測各組間DCFHDA標(biāo)記的胞漿ROS平均熒光強(qiáng)度的不同

3 討 論

微血管是終末循環(huán)末梢，在很大程度上決定組織灌注水平和氧供平衡。缺血后的再灌注時期產(chǎn)生了大量的活性氧ROS，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)過度的氧化應(yīng)激水平，損傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的功能，從而導(dǎo)致了細(xì)胞的功能障礙以及隨后的細(xì)胞程序性死亡過程[22]。而值得注意的是，在心臟的組織細(xì)胞中，心肌微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞是最易受到攻擊的，由于其在第一時間收到缺氧損傷的刺激，并且在第一時間恢復(fù)了血流[10]，因此微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞比心肌細(xì)胞和其他組織結(jié)構(gòu)更早發(fā)生再灌注損傷，出現(xiàn)臨床上常見的介入治療后再灌注并發(fā)癥-無復(fù)流。由于微循環(huán)的破壞，使得組織最終的能量和氧供得不到很好的補(bǔ)充，因此進(jìn)一步加重心肌梗死面積的擴(kuò)展以及隨后的心功能降低，造成心肌梗死圍術(shù)期的病死率顯著提高[23]。由此保護(hù)介入術(shù)后再灌注時期的微循環(huán)的穩(wěn)定，將會顯著提高PCI治療的效果，并增加心肌梗死患者圍術(shù)期的臨床獲益。

目前研究發(fā)現(xiàn)，再灌注時期，復(fù)氧期將會產(chǎn)生大量的ROS，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)過度的氧化應(yīng)激，損傷細(xì)胞的功能，造成微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞內(nèi)ROS的來源多種多樣：線粒體呼吸鏈[24]、NAD(P)H[25]、XO[26]以及一些蛋白底物代謝過程中產(chǎn)生的負(fù)離子電荷。由于內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體的缺乏，因此線粒體介導(dǎo)的ROS產(chǎn)生并不會很大程度上影響細(xì)胞的功能[27]。另一方面值得關(guān)注的是，XO途徑介導(dǎo)的ROS爆發(fā)可能是內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中被忽略的一部分。筆者團(tuán)隊的前期研究提示，CMEC中H/R條件下XO表達(dá)和轉(zhuǎn)錄明顯增加[28]， 有研究認(rèn)為XO是微血管內(nèi)皮中ROS大量產(chǎn)生的主要因素之一[29]。XDH作為XO的前體形式在細(xì)胞內(nèi)是持續(xù)表達(dá)的，在H/R條件下，大量XDH轉(zhuǎn)變?yōu)閄O[30]，生成過量ROS。其具體的機(jī)制為：缺氧條件下，細(xì)胞內(nèi)的ATP由于大量消耗被分解為ADP、AMP并最后代謝成為次黃嘌呤。一旦進(jìn)入再灌注時期，在氧的介導(dǎo)下，XO大量代謝次黃嘌呤生成尿酸的過程中將會生成大量的氧負(fù)離子[31]，由此造成細(xì)胞內(nèi)ROS含量的顯著升高。因此在我們的實驗中，建立了H/R模型來模擬缺血再灌注損傷。在模型中，復(fù)氧期將會顯著提高CMEC中的XO的含量，從而誘導(dǎo)ROS的爆發(fā)。由此說明H/R激活的XO是細(xì)胞內(nèi)ROS含量的重要決定因素，干預(yù)XO的蛋白水平以及轉(zhuǎn)錄活性，將會顯著降低細(xì)胞內(nèi)過度的活性氧，從而抑制氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。但是XO-ROS是如何誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的，目前研究甚少。

圖8 Confocol觀察不同組間XO和Caspase3熒光共定位染色

正常情況下，機(jī)體內(nèi)ROS生成和清除系統(tǒng)處于動態(tài)平衡，由于多種原因?qū)е碌腞OS生成增多或清除能力下降都會導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。細(xì)胞內(nèi)過量ROS生成可導(dǎo)致細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平增高、DNA氧化損傷、蛋白質(zhì)過氧化以及通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，例如：激活細(xì)胞NF-κB轉(zhuǎn)核，激活P53或SAPK通路誘導(dǎo)細(xì)胞，以及線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路[25]。本實驗發(fā)現(xiàn)在H/R模型中，由XO來源的過量胞漿ROS，是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。進(jìn)一步實驗發(fā)現(xiàn)，予以Liraglutide預(yù)處理或敲低XO，胞漿ROS生成明顯減少，同時可以在一定程度上降低caspase3表達(dá)量，最終保護(hù)CMEC在H/R條件下的結(jié)構(gòu)和功能。本實驗證實了在H/R條件下，XO-ROS是最終線粒體呼吸鏈ROS爆發(fā)的重要上游激活因子，應(yīng)當(dāng)作為早期保護(hù)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的重要靶點進(jìn)行更多的研究。

總之，Liraglutide可以通過恢復(fù)胞內(nèi)正常的XO-ROS水平，從而降低H/R導(dǎo)致的CMEC氧化應(yīng)激凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。