HPLC雙波長法測定小柄馬勃子實體、液體發(fā)酵菌絲中麥角甾醇和麥角甾酮含量

楊秀璐，孟佳啟，李 婷，王淑敏 *

（1．長春中醫(yī)藥大學藥學院，吉林 長春 130117；2．吉林延邊朝藥藥業(yè)有限公司，吉林 延邊 133000）

中藥馬勃Lycoperdonspp．屬于馬勃目（Lycoperdales） 馬勃屬（Lycoperdon） 大型藥用真菌，廣泛分布于世界各地?，F代研究表明，馬勃具有止血、抗?jié)?、抗炎等諸多藥理功效[1－3]。其化學成分主要有甾體類化合物、萜類化合物、小分子含氮化合物、多糖、微量元素等[4－8]。本試驗的研究對象小柄馬勃Lycoperdon pedicellatusPeck．是馬勃真菌中非常獨特的1種，因其野生資源較少，且馬勃品種繁多，所以小柄馬勃在國內外少有報道。甾體類成分是小柄馬勃的主要活性成分，本試驗通過建立小柄馬勃高效液相雙波長法，對其子實體與液體發(fā)酵菌絲中麥角甾醇和麥角甾酮含量進行分析，比較子實體和液體發(fā)酵菌絲之間的含量差異，為小柄馬勃和發(fā)酵菌絲的質量控制和進一步開發(fā)其食（藥）用價值提供理論依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC－20AT高效液相色譜儀，島津國際貿易上海有限公司；W201S恒溫水浴鍋，上海申生科技有限公司；EL204電子天平，梅特勒－托利多國際貿易上海有限公司；KQ－250B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；島津AUY220分析天平，島津國際貿易上海有限公司；ABB5－S十萬分之一電子天平，梅特勒－托利多國際貿易上海有限公司。

1.2 試驗藥品

麥角甾醇與麥角甾酮標準品，均購自上海源葉生物科技有限公司，麥角甾醇批號：J26M6K1，純度≥98%；麥角甾酮批號：X19M9L56204，純度≥98%。色譜甲醇，美國fisher公司。其他試劑均為分析純。小柄馬勃子實體，采自長春市凈月潭國家森林公園，經長春中醫(yī)藥大學王淑敏教授鑒定為小柄馬勃Lycoperdon pedicellatusPeck．；小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲，由長春中醫(yī)藥大學菌物藥研究室提供。

2 方法

2.1 樣品的制備

2．1．1 對照品溶液的制備

精密稱取2份不同質量的麥角甾醇對照品，加入甲醇溶解，定容于10 mL容量瓶中，分別得濃度為 0．02 mg·mL－1與 0．305 mg·mL－1的麥角甾醇對照品溶液。精密稱取麥角甾酮對照品適量，加入甲醇溶解，定容于 10 mL 容量瓶中，得濃度為 6．54 μg·mL－1麥角甾酮對照品溶液。

精密吸取 0．02 mg·mL－1麥角甾醇對照品溶液與6．54 μg·mL－1麥角甾酮對照品溶液按 1∶1 配置，最終得麥角甾醇 0．01 mg·mL－1、麥角甾酮 3．27 μg·mL－1混合對照品溶液 1；精密吸取 0．305 mg·mL－1麥角甾醇對照品溶液與 6．54 μg·mL－1麥角甾酮對照品溶液按1∶1 配置，最終得麥角甾醇 0．1525 mg·mL－1、麥角甾酮 3．27 μg·mL－1混合對照品溶液 2。

2．1．2 小柄馬勃子實體供試品溶液的制備

精密稱取小柄馬勃子實體38．70 mg，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL二氯甲烷，稱重，超聲30 min，再次稱重，用二氯甲烷補足減失的重量，搖勻，過濾，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解定容到1 mL的容量瓶中，即得麥角甾醇和麥角甾酮混合供試品溶液1。

精密稱取小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲2．0098 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL二氯甲烷，稱重，超聲30 min，再次稱重，用二氯甲烷補足減失的重量，搖勻，過濾，濾液水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解定容到5 mL的容量瓶中，即得麥角甾醇和麥角甾酮混合供試品溶2。

2.2 色譜條件

2．2．1 小柄馬勃子實體色譜條件

使用 Inertsil ODS－SP C18柱 （4．6 mm×250 mm，5 μm） 色譜柱，柱溫：30℃；流動相：甲醇；流速：0．8 mL·min－1；檢測波長：麥角甾醇與麥角甾酮分別為282 nm、349 nm；進樣量：18 μL；理論塔板數不低于 3 000[9－11]。

2．2．2 小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲色譜條件

色譜條件除進樣體積為10 μL外，同2．2．1項下小柄馬勃子實體色譜條件。

3 結果

3.1 小柄馬勃子實體HPLC色譜圖

小柄馬勃子實體HPLC色譜圖見圖1～圖4。

如圖1～圖4所示，供試品溶液1中麥角甾醇與麥角甾酮的保留時間，能夠分別與混合對照品1中麥角甾醇與麥角甾酮的保留時間相對應，且保留時間適宜，峰型良好，證明方法穩(wěn)定可靠。

3.2 小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲HPLC色譜圖

小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲的HPLC色譜圖見圖5～圖8。

如圖5～圖8所示，供試品溶液2中麥角甾醇與麥角甾酮的保留時間，能夠分別與混合對照品2中麥角甾醇與麥角甾酮的保留時間相對應，且保留時間適宜，峰型良好，證明方法穩(wěn)定可靠。

3.3 方法學考察

3．3．1 線性關系考察

按照2．2．1項下色譜條件，取混合對照品1溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL、18 μL、20 μL，注入液相色譜儀，進行測定。以峰面積值（A） 為縱坐標（Y），以含量（μg）為橫坐標（X），得麥角甾醇線性回歸方程為Y=1 460 264.17X-13 806.86（r=1），結果表明進樣量在0.02 μg～0.20 μg （r=1） 范圍內呈現良好的線性關系。

圖2 混合對照品溶液1麥角甾酮HPLC圖Fig.2 Chromatogram of ergosterone in mixed control solution 1

圖3 供試品溶液1麥角甾醇HPLC圖Fig.3 Chromatogram of ergosterol in sample solution 1

圖4 供試品溶液1麥角甾酮HPLC圖Fig.4 Chromatogram of ergosterone in sample solution 1

圖5 混合對照品溶液2麥角甾醇HPLC圖Fig.5 Chromatogram of ergosterol in mixed control solution 2

圖6 混合對照品溶液2麥角甾酮HPLC圖Fig.6 Chromatogram of ergosterone in mixed control solution 2

圖7 供試品溶液2麥角甾醇HPLC圖Fig.7 Chromatogram of ergosterol in sample solution 2

圖8 供試品溶液2麥角甾酮HPLC圖Fig.8 Chromatogram of ergosterone in sample solution 2

取混合對照品 2 溶液 2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL、18 μL、20 μL，注入液相色譜儀，按照“2.2.2”項下條件進行測定。以吸收峰面積值（A） 為縱坐標（Y），以質量（ng） 為橫坐標（X），分別得麥角甾醇線性回歸方程Y=1 696 290.87X-8 894.47（r=1） 與麥角甾酮線性回歸方程Y=8 291.78X-3 402.08（r=1）。結果表明進樣量分別在 0．305 μg～3．05 μg （r=1）、6．54 ng～65．4 ng（r=1） 范圍內呈現良好的線性關系。

3．3．2 精密度考察

按照2．2．2項下色譜條件，取10 μL麥角甾醇對照品溶液，注入高效液相色譜儀，重復測定6次。麥角甾醇峰面積值分別為2 187 971、2 192 214、2 195 844、2 197 362、2 197 958、2 195 471，經計算RSD值為0．17%，證明儀器精密度良好。

3．3．3 穩(wěn)定性考察

分別取小柄馬勃子實體供試品與小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲供試品溶液，進樣量為10 μL，分別在0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h注入高效液相色譜儀，按照2．2．1項下色譜條件進行檢測。小柄馬勃子實體中麥角甾醇的峰面積值分別為24 978、25 010、24532、 25 332、 24 699、 25 634， RSD 值 為1．61%；麥角甾酮峰面積值分別為37 105、35 968、37 824、36 947、37 232、37 562，RSD 值為 1．73%。結果表明樣品在24 h內穩(wěn)定。小柄馬勃的液體發(fā)酵菌絲中麥角甾醇的峰面積值分別為4 005 685、4 039 567、4 026 428、4 028 641、4 027 801、4 015 295，RSD值為0．29%；麥角甾酮的峰面積值分別為 91 823、91 850、93 468、91 931、93 754、92 185，經計算RSD值為0．94%，結果表明樣品在24 h內穩(wěn)定。

3．3．4 重復性考察

取同一批小柄馬勃子實體與小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲各6份，按照2．1．2項下供試品溶液制備方法制備，按照2．2．1項下色譜條件進行檢測。測得小柄馬勃子實體麥角甾醇的含量分別為 58．1073 μg·g－1、58．1879 μg·g－1、 57．7445 μg·g－1、 57．5793 μg·g－1、58．0 198 μg·g－1、57．3287 μg·g－1，RSD 值為 0．58%；麥角甾酮含量分別為 12．3055 μg·g－1、12．2099 μg·g－1、12．1727 μg·g－1、 12．2454 μg·g－1、 12．1613 μg·g－1、12．2811 μg·g－1，RSD 值為 0．48%。小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲中麥角甾醇的含量分別為 0．5917 mg·g－1、0．5890 mg·g－1、 0．5927 mg·g－1、 0．5925 mg·g－1、0．5939 mg·g－1、0．5936 mg·g－1，RSD 值為 0．30%；麥角甾酮的含量分別為 2．8711 μg·g－1、2．8647 μg·g－1、2．8979 μg·g－1、2．8642 μg·g－1、2．8845 μg·g－1、2．8745 μg·g－1，RSD 值為 0．45%，結果表明該方法重復性良好。

3．3．5 回收率考察

精密稱取已知麥角甾醇含量與麥角甾酮含量的小柄馬勃子實體與液體發(fā)酵菌絲供試品各6份，分別加入一定量的麥角甾醇與麥角甾酮標準品，按照2．1．2 項下方法制備樣品，按照 2．2．1 項下條件進行檢測，結果見表1～表4。

表1 子實體麥角甾醇回收率試驗（n=6）Tab．1 Recovery rate of ergosterol in fruiting body(n=6)

表2 子實體麥角甾酮回收率試驗（n=6）Tab．2 Recovery rate of ergosterone in fruiting body(n=6)

表3 液體發(fā)酵菌絲麥角甾醇回收率試驗（n=6）Tab．3 Recovery rate of ergosterol in liquid fermentation mycelium(n=6)

表4 液體發(fā)酵菌絲麥角甾酮回收率試驗（n=6）Tab．4 Recovery rate of ergosterone in liquid fermentation mycelium(n=6)

如表1～表4所示，小柄馬勃子實體中麥角甾醇與麥角甾酮的平均回收率分別為99．53%和96．80%，加樣回收率的RSD值分別為1．21%和1．55%，小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲中麥角甾醇與麥角甾酮的平均回收率分別為97．84%和98．89%，加樣回收率的RSD值分別為1．65%和1．91%，其回收率和相對標準偏差均在限度范圍內，表明樣品回收率高，方法準確、良好。

3．3．6 樣品含量測定

取小柄馬勃子實體與液體發(fā)酵菌絲，按照“2．1．2”項下方法制備樣品，按照“2．2．1”項下色譜條件進行含量測定，記錄吸收峰面積。小柄馬勃子實體中麥角甾醇的峰面積值分別為45 301、45 383、44 932，麥角甾酮的峰面積值分別為67 675、67 123、67 328，其平均含量分別為 58．01 μg·g－1、12．25 μg·g－1。小柄馬勃液體發(fā)酵菌絲中麥角甾醇的峰面積值分別為4 012 354、4 011 300、4 020 499；麥角甾酮的峰面積值分別為91 823、91 611、92 269，其平均含量分別為 0．59 mg·g－1、2．87 μg·g－1。

4 討論

本試驗采用HPLC雙波長法對小柄馬勃麥角甾醇和麥角甾酮的含量進行測定，結果顯示2種成分在子實體和液體發(fā)酵菌絲中的色譜條件一致，單次進樣供試品溶液，可分別在282 nm與349 nm處同時測定出麥角甾醇與麥角甾酮含量[12]，方法簡便，穩(wěn)定可靠，可作為小柄馬勃子實體與液體發(fā)酵菌絲中2種化學成分的含量測定的方法。

麥角甾醇作為真菌類的特征甾醇，是真菌生物量的重要指標之一，與真菌生物量存在著相關關系。同時馬勃的甾體類成分具有較強的生理活性，大量研究表明麥角甾醇抗炎效果顯著，而麥角甾酮具有利尿、抗腫瘤、免疫抑制等多種藥理功效[13－14]。所以利用HPLC雙波長法測定小柄馬勃中麥角甾醇與麥角甾酮的含量可為小柄馬勃的質量評價提供參考依據。

比較小柄馬勃子實體和液體發(fā)酵菌絲中麥角甾醇和麥角甾酮的含量，結果表明小柄馬勃子實體中麥角甾酮含量較高，液體發(fā)酵菌絲中麥角甾醇含量較高。推測其原因，一方面子實體是由菌絲進一步生長分化而來，所以在小柄馬勃不斷生長成熟形成子實體，并釋放孢子的過程中，不斷地產生麥角甾酮或有甾體類成分轉化為麥角甾酮，所以子實體中麥角甾酮含量要高于液體發(fā)酵菌絲。另一方面小柄馬勃液體發(fā)酵的過程中，菌絲長勢良好，分裂旺盛，而麥角甾醇又是其細胞膜的主要成分，所以麥角甾醇含量要高于傳統(tǒng)藥用部位子實體。因此在小柄馬勃的醫(yī)藥開發(fā)過程中，我們可以根據實際需要選擇不同的藥用部位，同時也可以通過藥理、藥效學研究進一步考察液體發(fā)酵產物代替野生資源的可能性，以便更好地實現小柄馬勃的開發(fā)與合理應用。