平菇漆酶對(duì)農(nóng)藥六六六降解作用研究*

劉紹雄，李建英，劉春麗，王明月，張微思，羅孝坤

（1．中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221；2．云南省供銷合作社科學(xué)研究所，云南 昆明 650221；3．云南省農(nóng)村科技服務(wù)中心，云南 昆明 650021）

有機(jī)氯農(nóng)藥是一類應(yīng)用較早的高效廣譜殺蟲劑，被廣泛用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)中，由于其具有長(zhǎng)期殘留性、生物富集性和高毒性等特征，而受到全世界的廣泛關(guān)注[1－2]。六六六又名六氯環(huán)己烷（Hexachlorocyclohexane，HCH），是最為常見(jiàn)的有機(jī)氯農(nóng)藥，我國(guó)從1983年開(kāi)始禁止六六六的生產(chǎn)和使用，但因其理化性質(zhì)穩(wěn)定，半衰期較長(zhǎng)，自然降解緩慢[3－4]，長(zhǎng)期在自然界中富集、遷移，目前水、土壤、作物、林木中仍能檢出，殘留風(fēng)險(xiǎn)依然存在[5]。而在食用菌的生產(chǎn)過(guò)程中，農(nóng)林副產(chǎn)物是主要的原料資源，被污染的農(nóng)林副產(chǎn)物將對(duì)食用菌造成間接污染，給食用菌產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來(lái)了嚴(yán)重威脅。

食用菌漆酶是在食用菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中產(chǎn)生的1種多酚氧化酶[6-8]。有研究表明[9-10]，在食用菌菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中，食用菌自身對(duì)農(nóng)藥殘留具有降解作用，使農(nóng)藥殘留量不斷減少。漆酶作為食用菌胞外酶系的重要成員，勢(shì)必在其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中和有機(jī)氯農(nóng)藥殘留降解作用中發(fā)揮著重要作用。目前漆酶對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥六六六的降解作用及菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中的消解動(dòng)態(tài)作用的研究鮮有報(bào)道。本文通過(guò)研究平菇漆酶對(duì)農(nóng)藥六六六的降解作用，以期為農(nóng)藥六六六殘留治理、食用菌栽培安全生產(chǎn)等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：平菇89，由中華全國(guó)供銷合作總社昆明食用菌研究所菌種中心提供。

主要試劑：六六六標(biāo)準(zhǔn)品溶液（δ-六六六）、ABTS、冰乙酸、無(wú)水乙酸鈉、葡萄糖等試劑均購(gòu)于云南晨綠生物科技有限公司。

主要儀器：水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫振蕩培養(yǎng)箱等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 平菇在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)漆酶特性

（1）漆酶粗酶液制備

將平菇菌株接入30 mL PDA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，接種塊大小2 cm×0.7 cm×0.2 cm（長(zhǎng)×寬×厚），每瓶3片～5片，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱24℃、110 r·min-1培養(yǎng)12 d，每隔2 d提取1次培養(yǎng)液，離心后取其上清液，即為粗酶液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆肹11]。

（2）漆酶酶活性測(cè)定

平菇漆酶酶活性測(cè)定采用ABTS法[11]。定義每分鐘使吸光值增加0.1所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U）[12-13]。

1.2.2 漆酶對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥的降解作用

設(shè)置對(duì)照CK（不加粗酶液）、加酶量1（加酶量為1.5 U·mL-1）、加酶量2（加酶量為3 U·mL-1）、加酶量3（加酶量為4.5 U·mL-1）和加酶量4（加酶量為6 U·mL-1）共5個(gè)處理，分別加入農(nóng)藥六六六溶液（濃度為5 μg·L-1），采用GB/T 5009.19[14]方法，測(cè)定農(nóng)藥六六六殘留量。

1.2.3 漆酶酶活性與農(nóng)藥六六六殘留變化規(guī)律

滅菌后在培養(yǎng)基中添加農(nóng)藥六六六（濃度為10 μg·L-1），以不添加農(nóng)藥六六六為對(duì)照（CK），將平菇菌株接種于培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱24℃、110 r·min-1培養(yǎng)，每隔2 d取1次培養(yǎng)液，測(cè)定培養(yǎng)液漆酶酶活性和農(nóng)藥六六六殘留量。

1.2.4 農(nóng)藥六六六在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中的消解動(dòng)態(tài)

滅菌前后分別在培養(yǎng)基中添加有農(nóng)藥六六六（濃度為10 μg·L-1），測(cè)定高溫高壓滅菌對(duì)農(nóng)藥降解的影響。滅菌后在培養(yǎng)基中添加有農(nóng)藥六六六（濃度為10 μg·L-1），將平菇菌株接種于培養(yǎng)基中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱24℃、110 r·min-1培養(yǎng)20 d，每隔4 d取1次培養(yǎng)液，測(cè)定培養(yǎng)液中農(nóng)藥六六六殘留量。

2 結(jié)果與分析

2.1 平菇產(chǎn)漆酶規(guī)律變化研究

平菇菌株在液體培養(yǎng)基中漆酶酶活性變化結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 平菇菌株在液體培養(yǎng)基中漆酶活性Fig.1 Laccase activity of Pleurotus ostreatus in liquid medium

由圖1可以看出，平菇菌株在液體培養(yǎng)基生長(zhǎng)過(guò)程中，漆酶酶活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加漆酶酶活性逐漸增強(qiáng)，第6天時(shí)漆酶酶活性增長(zhǎng)開(kāi)始放緩，8 d達(dá)到峰值，為4.79 U·mL-1，隨后隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，酶活性逐漸降低。

2.2 平菇漆酶對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥的降解作用研究

不同濃度漆酶液對(duì)農(nóng)藥六六六的降解作用結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，隨著漆酶濃度的增加，農(nóng)藥六六六殘留減少，且呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，相關(guān)性系數(shù)R值為0.993，這說(shuō)明平菇漆酶對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥六六六具有降解作用。

2.3 平菇漆酶活性與農(nóng)藥六六六殘留變化規(guī)律研究

平菇漆酶酶活性與農(nóng)藥六六六殘留變化規(guī)律研究結(jié)果見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，在添加農(nóng)藥后，農(nóng)藥對(duì)平菇漆酶酶活性影響較大，漆酶酶活性整體偏低，最大酶活為8.26 U·mL-1。而不加農(nóng)藥時(shí)，漆酶酶活達(dá)到峰值時(shí)，酶活為20.06 U·mL-1。從農(nóng)藥殘留量變化和漆酶酶活性變化來(lái)看，隨著平菇漆酶酶活性的逐漸增強(qiáng)，有機(jī)氯農(nóng)藥六六六殘留量逐漸減少，培養(yǎng)到2 d～6 d時(shí)，菌絲活力最強(qiáng)，菌絲生長(zhǎng)速度最快，有機(jī)氯農(nóng)藥六六六殘留下降得最快。

圖2 平菇漆酶對(duì)農(nóng)藥六六六的降解作用Fig.2 Degradation of HCH by laccase of Pleurotus ostreatus

圖3 平菇漆酶變化與農(nóng)藥六六六殘留變化規(guī)律Fig.3 Regularity of the changes of laccase of Pleurotus ostreatus and HCH residue

2.4 農(nóng)藥六六六在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中的消解動(dòng)態(tài)

高溫滅菌對(duì)農(nóng)藥六六六降解情況的影響和農(nóng)藥六六六在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中的消解動(dòng)態(tài)變化，見(jiàn)表1和圖4。

表1 高溫滅菌對(duì)農(nóng)藥六六六降解情況影響Tab.1 Effect of high temperature sterilization on the degradation of HCH

圖4 農(nóng)藥六六六在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中的消解動(dòng)態(tài)Fig.4 Degradation dynamics of HCH during the growth of mycelium

由表1可以看出，培養(yǎng)基中的農(nóng)藥六六六通過(guò)高溫高壓滅菌后未檢出，幾乎完全降解。從圖4可以看出，在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中，農(nóng)藥六六六殘留量隨著菌絲培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降解，降解方程為y=6.3993e-0.099x（R2=0.9728）。通過(guò)方程可計(jì)算出農(nóng)藥六六六在液體培養(yǎng)基菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中，半衰期為7.0 d。

3 結(jié)論與討論

平菇菌株在液體培養(yǎng)基中，漆酶酶活性隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加先逐漸增強(qiáng)，8 d達(dá)到峰值，隨后逐漸降低。漆酶參與了菌絲體的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用，平菇菌株在液體培養(yǎng)基中生物量逐漸達(dá)到最大。然后隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分的減少，菌絲活力開(kāi)始減弱，菌絲生長(zhǎng)速度開(kāi)始下降，表明漆酶酶活性在一定程度反映了菌絲的活力，這與黎志銀[10]、張權(quán)等[15]相關(guān)研究相似。

平菇漆酶對(duì)有機(jī)氯農(nóng)藥六六六具有降解作用，漆酶酶活性與農(nóng)藥降解呈正相關(guān)關(guān)系。在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中，隨著平菇漆酶酶活性的逐漸增加，有機(jī)氯農(nóng)藥六六六殘留量逐漸減少，說(shuō)明平菇菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中可以通過(guò)自身產(chǎn)生的漆酶對(duì)培養(yǎng)基中的有機(jī)氯農(nóng)藥六六六進(jìn)行分解。

農(nóng)藥六六六在菌絲生長(zhǎng)過(guò)程中，殘留量隨著菌絲培養(yǎng)而逐漸減少，半衰期為7.0 d，對(duì)平菇漆酶影響較大，會(huì)降低了培養(yǎng)基中漆酶酶活性。平菇在PDA液體培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)時(shí)間為5 d～7 d，甚至更短，在培養(yǎng)過(guò)程中，農(nóng)藥殘留抑制了菌絲的生長(zhǎng)，從而影響漆酶酶活性。

高溫滅菌后農(nóng)藥六六六幾乎完全降解，在農(nóng)藥六六六污染較嚴(yán)重的地區(qū)，食用菌采用高溫滅菌的熟料栽培方式更為安全。