富氫鹽水拮抗順鉑對小鼠耳毒性的作用研究

盧燕 林信衡 蔡友錚 徐浩 王宏波 吳小波 林昶 鐘秀榮 孫麗清

1福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（福州350009）

2福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（福州350001）

3青島泛潤經(jīng)貿(mào)有限公司（青島266107）4福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（福州350005）5福建醫(yī)科大學(xué)公共技術(shù)中心電鏡室（福州350122）

順鉑作為一種高效抗癌藥，被廣泛用于治療多種惡性腫瘤[1]。然而該藥具有嚴(yán)重的耳毒性、肝腎毒性及骨髓抑制等，成為影響其臨床應(yīng)用乃至停藥終止化療的重要因素。Previati等[2]研究結(jié)果示在分子水平順鉑的耳毒性和腎毒性與活性氧的產(chǎn)生有關(guān)，可導(dǎo)致細(xì)胞活性氧的大量基因轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生大量的活性氧。耳蝸內(nèi)活性氧的增加可進(jìn)一步引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、毛細(xì)胞內(nèi)鈣超載，導(dǎo)致毛細(xì)胞凋亡，使用者可出現(xiàn)高達(dá)93%的感音神經(jīng)性聾[1]和耳鳴，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，防治順鉑引起的耳毒性尤為重要。近年來，氫分子學(xué)的大量研究，提示富氫鹽水、飽和氫生理鹽水[3-7]具有滲透快、無毒副作用、價格便宜，可有效通過血-迷路屏障清除噪聲引起的耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)大量氧自由基，發(fā)揮選擇抗氧化作用，減少毛細(xì)胞的凋亡。本研究通過腹腔注射順鉑，建立小鼠耳毒性模型，從聽力學(xué)及形態(tài)學(xué)兩方面驗證富氫鹽水能否通過清除耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，拮抗順鉑引起的耳毒性，從而對化療過程中順鉑引起的耳蝸損傷起到一定的保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

體重25-30g健康、聽性腦干誘發(fā)反應(yīng)（ABR）閾值正常的C57小鼠30只。雌雄不限，由福建醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，動物合格證編號2015000500962。

1.2 實驗試劑

富氫鹽水（青島泛潤經(jīng)貿(mào)有限公司提供），順鉑（江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，批號170305），0.9%生理鹽水（福州海王福藥制藥有限公司提供批號 150807002）。

1.3 方法

1.3.1 動物分組

隨機(jī)分成3組，對照組（單純腹腔注射生理鹽水組）10只；順鉑組（單純腹腔注射順鉑）10只；富氫鹽水組（腹腔注射順鉑+富氫鹽水）10只。

1.3.2 動物造模

對照組及順鉑組，每天分別腹腔注射0.9%生理鹽水和順鉑4mg/kg，連續(xù)注射7天；富氫鹽水組，每天腹腔注射順鉑4mg/kg后立即再腹腔注射新鮮配置的富氫鹽水1ml/100g，連續(xù)注射7天。

1.3.3 聽力學(xué)檢測

腹腔注射上述液體7天后立即行聽性腦干誘發(fā)反應(yīng)（ABR）檢測。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠（0.4ml/kg）。使用丹麥ICS ABR儀，參考電極插入測試耳耳垂，地極插入對側(cè)耳耳垂，記錄電極插入顱頂正中，在聽力室內(nèi)以短聲（Click）作為刺激聲，以能分辨出可重復(fù)的ABR波III的最低刺激強(qiáng)度判斷閾值。

1.3.4 掃描電鏡標(biāo)本制備

第7天聽力檢測完后，立即斷頭，取出雙耳聽泡，快速分離耳蝸，將耳蝸浸在2.5%戊二醛固定液中，在解剖顯微鏡下用1ml注射器針尖在蝸尖打孔，挑破圓窗膜，用鑷子取出鐙骨。用帶有橡膠頭的微細(xì)玻璃管吸取2.5%戊二醛固定液從蝸尖小孔灌注耳蝸5次，使固定液從蝸尖流向蝸底，經(jīng)前庭階、鼓階從卵圓窗和圓窗流出。將耳蝸放在含有該固定液的5mlEP管中4°C冰箱固定4小時。用10%EDTA脫鈣7天(每天換液）。1%四氧化鋨后固定2小時。用0.1mol/L的磷酸緩沖液（PBS）充分漂洗耳蝸后，在解剖顯微鏡下用鑷子去除耳蝸骨殼、螺旋韌帶及前庭膜，盡可能的去掉蓋膜，充分暴露螺旋器。將解剖好的標(biāo)本放進(jìn)2%單寧酸溶液中導(dǎo)電染色1小時，然后行梯度乙醇脫水（50%、70%、90%、100%）2次，每次每級濃度脫水30分鐘。醋酸異戊酯置換乙醇，用EMITECH K850臨界點(diǎn)干燥儀干燥標(biāo)本，Quorum Q150R ES真空離子濺射儀進(jìn)行鍍膜后，裝于有干燥劑的玻璃干燥器內(nèi)密閉保存。用SU8000高分辨掃描電鏡觀察并拍攝照片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以表示，ABR閾值自身給藥前后選用配對樣本t檢驗，三組間兩兩比較采用單因素ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 聽力學(xué)結(jié)果

2.1.1 ABR測試結(jié)果

給藥前，各組本底ABR閾值均正常，三組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.902）。給藥后順鉑組、富氫鹽水組ABR閾值均明顯高于給藥前，有差異統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），對照組給藥前后比較無差異（P=0.077），無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組、富氫鹽水組ABR閾值均明顯低于順鉑組，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；富氫鹽水組給藥后ABR閾值明顯高于對照組，，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。提示富氫鹽水有拮抗順鉑對小鼠耳毒性的作用，可減輕順鉑引起的聽功能損傷，起到了一定的保護(hù)作用。見表1，圖1。P＜0.001before administration v.s.after administration;***P＜0.001 among groups before or after administration.

圖1 給藥前后各組小鼠ABR閾值變化比較給藥前，各組本底ABR閾值正常，三組間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）;給藥后，三組間均有統(tǒng)計學(xué)差異，###P＜0.001,各組用藥前后之間比較；***P＜0.001，用藥前后組間比較。Fig.1 ABR thresholds changes before and after administration Before administration,there were no significant differences among groups(P＞0.05).After administration,the ABR thresholds of cisplatin group and hydrogen-rich saline group were significantly increased compared with control group.However,the ABR thresholds of hydrogen-rich saline group were significantly lower than those of cisplatin group.###

2.1.2 掃描電鏡觀察結(jié)果

掃描電鏡下可見對照組耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞及靜纖毛結(jié)構(gòu)完整，靜纖毛無明顯缺失、散亂、倒伏。順鉑組動物耳蝸基底膜第一圈內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛廣泛性缺失，剩余靜纖毛散亂、倒伏；外毛細(xì)胞散在缺失；第一、二排外毛細(xì)胞靜纖毛個別缺失、倒伏；第三排外毛細(xì)胞靜纖毛廣泛性缺失，剩余靜纖毛排列散亂、倒伏，表皮板塌陷破裂。第二圈內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛散在缺失、倒伏；外毛細(xì)胞靜纖毛未見明顯缺失、倒伏和融合，表皮板塌陷破裂。富氫鹽水組動物耳蝸第一圈內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛散在缺失，排列稍散亂，無倒伏；外毛細(xì)胞靜纖毛僅見個別自然缺失，個別靜纖毛輕度融合，表皮板輕度破裂。第二圈內(nèi)、外毛細(xì)胞靜纖毛未見明顯缺失、散亂、倒伏和融合，僅見表皮板破裂。（見圖2）

圖2 A、B分別為對照組耳蝸第一、二圈，耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞及靜纖毛結(jié)構(gòu)完整，靜纖毛無明顯缺失、散亂、倒伏。C、D圖為順鉑組耳蝸第一、二圈，C圖可見內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛廣泛性缺失、倒伏，外毛細(xì)胞靜纖毛部分缺失，剩余靜纖毛散亂、倒伏，表皮板塌陷破裂；D圖可見內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛散在缺失、倒伏；外毛細(xì)胞靜纖毛未見明顯缺失、倒伏和融合，表皮板塌陷破裂。E、F分別為富氫鹽水組耳蝸第一、二圈，內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛散在缺失，排列稍散亂，無倒伏，外毛細(xì)胞靜纖毛僅見個別自然缺失，個別靜纖毛輕度融合，表皮板輕度破裂；第二圈內(nèi)、外毛細(xì)胞靜纖毛未見明顯缺失、散亂、倒伏和融合，僅見表皮板破裂。Fig.2 A and B The first and second turns of cochlea in the control group.The hair cells（including inner and outer hair cells）and stereocilia structure were intact with no obvious lack,scattered,and lodging of stereocilia;C and D The first and second turns of cochlea in the cisplatin group.There were widespread lack of stereocilia in the inner hair cells and the loss of the stereocilia in the outer hair cells.The remaining stereocilia were scattered and collapsed,and the cuticular plate collapsed and ruptured.D The stereocilia of the inner hair cells were absent and inverted,while there was no obvious loss,collapse or fusion of the stereocilia in the outer hair cells,and the cuticular plate collapsed and ruptured.E and F The first and second turns of cochlea in the hydrogen-rich saline group,respectively.The stereocilia of inner hair cells were absent，the arrangement was slightly scattered,with no collapse.A few stereocilias of outer hair cells were absent or fused,with slightly cuticular plates broken.In the second turn,there was no obvious loss,disorder,collapse or fusion in the stereocilia of the outer hair cells,only the cuticular plate was broken.

表 1 ABR 閾值（±s，n=20）（dB nHL）Table 1 ABR Threshold（±s，n=20）（dB nHL）

表 1 ABR 閾值（±s，n=20）（dB nHL）Table 1 ABR Threshold（±s，n=20）（dB nHL）

Group Control group Cisplatin group Hydrogen-rich saline group Ear 20 20 20 ABR thresholds Before administration 16.50±0.86 16.75±0.06 17.00±0.40 After administration 18.50±4.01 56.00±0.95 28.75±5.82

3 討論

順鉑的致聾機(jī)制目前尚不完全清楚，主要包括自由基機(jī)制、凋亡機(jī)制、血管紋功能障礙等機(jī)制。大量研究顯示順鉑的耳毒性與產(chǎn)生過量的活性氧自由基及降低耳蝸組織中的抗氧化酶類活性有關(guān)[8-10]。正常情況下，耳蝸具有自己的活性氧清除系統(tǒng)，主要以超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶等抗氧化酶的形式存在于Corti器及血管紋[11]，維持著正常的活性氧動態(tài)平衡。只有當(dāng)活性氧的生產(chǎn)增加或清除系統(tǒng)功能下降時，活性氧蓄積才會引起耳蝸組織的氧化損傷。已知給予適當(dāng)?shù)目寡趸瘎┧幬锬軌驕p輕順鉑引起的內(nèi)耳損傷[9]，如硫普羅寧、白藜蘆醇、維生素E、褪黑素、n-乙酰半胱氨酸、水楊酸鈉、大蒜素等均可降低順鉑的耳毒性。然而，其中大部分藥物同時被發(fā)現(xiàn)可協(xié)同減弱順鉑的抗腫瘤作用[12]。而楊慶璽[13]研究證明應(yīng)用富氫水對惡性腫瘤化療病人有明顯的減毒增效作用。因此，我們大膽推測在順鉑應(yīng)用早期及時給予適當(dāng)?shù)母粴潲}水，可以抑制耳蝸組織中氧自由基的產(chǎn)生，減少氧化損傷，改善耳蝸組織內(nèi)的抗氧化防御體系，從而減輕順鉑的耳毒性。故本實驗選擇在腹腔注射順鉑后立即腹腔注射富氫鹽水。本實驗給藥后，順鉑組的ABR閾值明顯升高，富氫鹽水組的ABR閾值也較給藥前明顯升高，但明顯低于順鉑組，高于對照組，提示富氫鹽水起到了一定的拮抗順鉑耳毒性的作用，對小鼠的聽力起到了一定的保護(hù)作用。上述數(shù)據(jù)說明富氫鹽水對順鉑引起的小鼠耳毒性也有一定的保護(hù)作用。

目前富氫鹽水被廣泛研究于各種動物模型，發(fā)現(xiàn)其對多種疾病具有保護(hù)作用，可顯著改善心肌缺血再灌注損傷、小腸缺血再灌注損傷、阿爾茨海默病的記憶功能等[13-16]。本研究通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，順鉑可引起耳蝸內(nèi)外細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞與損傷，而且內(nèi)毛細(xì)胞靜纖毛缺失情況較外毛細(xì)胞重，第一圈損傷較第二圈損傷重。腹腔注射富氫鹽水后可明顯減輕耳蝸內(nèi)外毛細(xì)胞靜纖毛的損傷缺失。進(jìn)一步也從形態(tài)學(xué)上驗證了富氫鹽水可有效減輕順鉑引起的耳蝸損傷，對順鉑致小鼠耳毒性起到一定程度的保護(hù)作用。其機(jī)理可能是富氫鹽水通過快速滲透，進(jìn)入血-迷路屏障，有效清除順鉑產(chǎn)生的大量氧自由基，發(fā)揮其選擇性抗氧化作用，減少內(nèi)外毛細(xì)胞的凋亡。但具體作用機(jī)制尚不明確。許多研究顯示，細(xì)胞凋亡在順鉑的耳毒性作用中同樣起著重要作用。歐洲學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，耳蝸毛細(xì)胞和前庭毛細(xì)胞的順鉑耳毒性培養(yǎng)基培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)了大量的腫瘤抑制基因—p53免疫組織化學(xué)陽性產(chǎn)物，據(jù)此推測順鉑有可能通過調(diào)控p53通路引起耳蝸組織內(nèi)毛細(xì)胞的凋亡[17]。富氫鹽水能否通過p53通路減輕順鉑引起的耳蝸毛細(xì)胞的凋亡尚不明確，在后續(xù)的研究中課題組將用Tunel檢測來驗證這一結(jié)果，為進(jìn)一步闡述富氫鹽水拮抗順鉑耳毒性的作用機(jī)理提供依據(jù)。

目前已有臨床研究將富氫鹽水通過口服的方式給予正在化療的惡性腫瘤患者服用，富氫鹽水對順鉑引起的骨髓抑制、肝腎毒性、心臟有顯著的保護(hù)作用[12]。本實驗因是動物實驗，我們無法定時、定量控制小鼠對富氫鹽水的飲用量，故采用了腹腔注射的方法，更容易方便、快捷的進(jìn)行量化富氫鹽水對順鉑的影響。在今后的臨床應(yīng)用中，我們可以采用口服的方法，像正常口服藥物或者作為正常飲用水來飲用用于惡性腫瘤患者化療前和化療過程中，甚至化療結(jié)束休息期，來預(yù)防和減輕順鉑引起的耳毒性，從而減少患者的聽力損害，減少感音神經(jīng)性聾及耳鳴的發(fā)生，提高生活質(zhì)量。因此，富氫鹽水對惡性腫瘤化療患者帶來了新的福音，具有巨大的臨床應(yīng)用前景和社會效益。

本研究通過聽力學(xué)及形態(tài)學(xué)方面的研究，初步探討了富氫鹽水拮抗順鉑耳毒性的作用，為臨床防治順鉑引起的聽力損害提供新的實驗依據(jù)，也為全面深入研究富氫鹽水拮抗順鉑耳毒性的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本實驗因尚處在研究初期，課題組將在后續(xù)的實驗研究中進(jìn)一步探討腹腔注射順鉑后不同時間點(diǎn)腹腔注射富氫鹽水，富氫鹽水拮抗順鉑的耳毒性作用等問題，并進(jìn)一步探討富氫鹽水拮抗順鉑耳毒性的分子機(jī)制、藥代動力學(xué)，進(jìn)一步明確最佳給藥時間、給藥濃度及給藥頻率、方式。