Circular RNAs：鑒定、表達(dá)和功能

李 輝，曹修凱，楊嘉蒙，陳 宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌712100)

1 circRNA的發(fā)現(xiàn)

1991年Nigro等利用RT-PCR和測序技術(shù)分析人DCC(deleted in colon cancer)基因外顯子連接時偶然發(fā)現(xiàn)了4個潛在的circRNA[1]。1993年Capel等發(fā)現(xiàn)小鼠Sry(sex-determining region on the Y chromosome)基因可以產(chǎn)生circRNA，這是證實(shí)circRNA存在的另一個實(shí)例。在發(fā)育生殖脊中Sry基因可以轉(zhuǎn)錄成mRNA并翻譯成Sry蛋白，在胚胎發(fā)育中起到性別決定的作用。但是，在成年小鼠睪丸組織中，Sry基因被特異轉(zhuǎn)錄成了1.23-kb的circRNA[2]。大量研究表明這一circRNA并沒有被翻譯，這使得人們不禁對它的功能意義產(chǎn)生了疑問。

之后又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些circRNA基因(circRNA-producing gene)，包括人轉(zhuǎn)錄因子ETS-1、人/鼠細(xì)胞色素P450、鼠SHBG(sex hormone binding globulin)、人dystrophin。此外，猴子NCX1和果蠅mbl據(jù)信具有很高的豐度，并且可以調(diào)控異常RNA亞型(circRNA)[3]。最近，人ANRIL(一個非編碼RNA，豐度較低)可以發(fā)生環(huán)化，并且CDR1位點(diǎn)的反義轉(zhuǎn)錄可以產(chǎn)生高豐度的circRNA。至此，人們普遍認(rèn)為circRNA是一種罕見的RNA形式，具有有限的生物學(xué)意義。

2012年小兒急性淋巴細(xì)胞性白血病樣本的RNA測序揭示了circRNA的全基因組表達(dá)屬性，并且這種現(xiàn)象同樣存在于健康個體的白細(xì)胞中[4]。此外，生物信息學(xué)分析也證實(shí)并拓展了這些發(fā)現(xiàn)。這些研究結(jié)果為一個新領(lǐng)域的快速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。將這些研究結(jié)果整理，發(fā)現(xiàn)circRNA是很豐富的，數(shù)以千計(jì)的人類基因可以表達(dá)circRNA，并且有時它們的表達(dá)量要高于其同源線性亞型[5-6]；circRNA具有表達(dá)特異性、序列保守性(人與小鼠)，定位于胞質(zhì)，穩(wěn)定性強(qiáng)，半衰期超過48 h；天然存在的circRNA不會被翻譯(人工合成的具有核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的circRNA在體內(nèi)/外均可被翻譯)[7]；它們通常是由pre-mRNA的較長的外顯子和較長的側(cè)翼內(nèi)含子構(gòu)成(圖1)，側(cè)翼內(nèi)含子中富含互補(bǔ)的ALU元件，它們在許多circRNA合成中發(fā)揮功能。這些結(jié)論具有一般性，但不能排除特例的存在。

(a)套索驅(qū)動(lariat-driven)環(huán)化；(b)內(nèi)含子配對驅(qū)動(intron-pairing-driven)環(huán)化；(c)環(huán)形內(nèi)含子RNA(ciRNA)；(d)RBP或反式作用因子驅(qū)動環(huán)化。

圖1 circRNA的合成[8]

2 circRNA的鑒定與特性分析

生化方法和生物信息學(xué)分析是檢測circRNA及其表達(dá)的主要手段.

(1)circRNA特性分析的生化方法

生化實(shí)驗(yàn)是鑒定和驗(yàn)證circRNA的重要方法，其中qRT-PCR是最基礎(chǔ)的方法之一。 circRNA首先被反轉(zhuǎn)錄成cDNA，這一cDNA序列中含有標(biāo)志性的外顯子-外顯子連接序列，而正常剪接得到的mRNA不含這種連接序列。因而在設(shè)計(jì)引物時可以特異擴(kuò)增這個標(biāo)志性的連接序列。這種引物稱為反向(inverse or outward-facing primers)引物，因?yàn)楫?dāng)比對到基因組時，它們的3’端是相互遠(yuǎn)離的，這不同于標(biāo)準(zhǔn)PCP(3’端相互靠近)。這樣就可以將mRNA和基因組DNA區(qū)分開來。qPCR可以快速檢測circRNA的相對豐度。

盡管qPCR簡單高效，但它存在一些缺陷。mRNA模板置換(template switching)、反式剪接(trans-splicing)、基因組重復(fù)均有可能在外顯子-外顯子連接序列處發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致線性轉(zhuǎn)錄本具備了circRNA特有的外顯子-外顯子連接序列。此外，對circRNA的反轉(zhuǎn)錄具有滾環(huán)反轉(zhuǎn)錄(rolling-circle)現(xiàn)象，導(dǎo)致外顯子串聯(lián)。凝膠電泳時條帶呈梯度分布，這表明了circRNA的存在，但這也會導(dǎo)致對circRNA的過高估計(jì)[9-11]。

Northern blot也是一種簡單、高效檢測circRNA的方法。探針可以靶向到circRNA的外顯子序列或特異性地靶向到外顯子連接序列。與qPCR相比Northern blot在circRNA定性上更具有優(yōu)勢，因?yàn)槟康腸ircRNA具有特定的遷移率[2]。

核糖核酸酶R(RNase R)具有3’-5’核酸外切酶活性，它通常與上述方法結(jié)合使用，來判定circRNA的真實(shí)性或從測序文庫中富集circRNA[12-13]。但是RNase R會導(dǎo)致技術(shù)噪音，因?yàn)镽Nase R也可以使一些circRNA降解(或許與RNA的內(nèi)源性切口及核酸酶污染有關(guān))，一些3’端發(fā)生堿基配對的線性RNA不被降解。并且考慮到這種酶的效率，處理后的樣品中或許仍然存在線性RNA的片段。正是由于這個原因，采用一個量化指標(biāo)來衡量消化效率是很有必要的，例如Real-time quantitative PCR(qPCR)法。此外核酸酶XRN1(應(yīng)用較少)具有5’-3’外切酶活性，與RNase R的使用方式相似，但在使用前需要利用煙酸焦磷酸酶(tobacco acid pyrophosphatase, TAP)對mRNA進(jìn)行去帽處理。綜上，qPCR+Northern blot +核酸外切酶是鑒定RNA環(huán)化的有力工具。

核糖核酸內(nèi)切酶H(Rnase H)也可以用來檢測RNA環(huán)化。RNase H可以將RNA-DNA雜交雙鏈中的RNA切斷，因此當(dāng)1個DNA探針結(jié)合到目的RNA上后，該RNA會被RNase H切割。線性RNA的電泳結(jié)果呈現(xiàn)2條帶，而circRNA呈現(xiàn)1條帶。并且線性化會改變circRNA電泳遷移速度。此外，二維變性聚丙烯酰胺凝膠電泳也可以用來區(qū)分circRNA和線性RNA[14]。

對于circRNA的富集，除了核糖核酸外切酶處理法和二維電泳法外[15]，rRNA消耗法(ribosomal RNA depletion)和polyA消耗法也是在構(gòu)建circRNA測序文庫時常用的富集方法。然而這兩種方法都不能保證富集序列的特異性，因?yàn)槠渌恍╊愋偷姆蔷幋aRNA仍然會存在。盡管如此，RNA-seq 結(jié)合生物信息學(xué)分析可以在全基因組范圍內(nèi)檢測circRNA的表達(dá)，并且原則上可以將偽circRNA(artifactual circRNA)與真實(shí)circRNA區(qū)分開。例如，將RNase R與rRNA消除處理后樣本的circRNA檢測率進(jìn)行比較就可以檢測出真實(shí)的circRNA。在進(jìn)行這種分析前，需要對RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。但是RNA-seq前的生化處理/純化并不是基因組范圍內(nèi)鑒定circRNA的金標(biāo)準(zhǔn)。Jeck等發(fā)現(xiàn)由CDR1反義轉(zhuǎn)錄本形成的circRNA經(jīng)過RNase R處理后發(fā)生了降解。

(2)外源circRNA的表達(dá)：circRNA的發(fā)生與功能

目前還不能針對內(nèi)源circRNA的位點(diǎn)進(jìn)行干擾或誘導(dǎo)表達(dá)。因此過表達(dá)載體是研究circRNA的常用工具。這種載體通常含有環(huán)化外顯子、側(cè)翼剪接信號、內(nèi)含子(含有反向互補(bǔ)序列，促進(jìn)剪接成環(huán))。但是，這種載體會導(dǎo)致滾環(huán)轉(zhuǎn)錄本的形成。RNA聚合酶會繞過轉(zhuǎn)錄終止信號，轉(zhuǎn)錄整個質(zhì)粒，導(dǎo)致環(huán)化外顯子發(fā)生串聯(lián)重復(fù)，這種pre-mRNA會按照傳統(tǒng)剪接方式進(jìn)行剪接，最終形成環(huán)化外顯子串聯(lián)的線性RNA。利用檢測circRNA的方法無法將這種外顯子串聯(lián)的線性RNA與真實(shí)的circRNA區(qū)分開，因?yàn)榍罢咭埠衏ircRNA的標(biāo)志性連接序列。

(3)circRNA的生物信息學(xué)鑒定

除了上述生化方法外，利用生物信息學(xué)對circRNA進(jìn)行預(yù)測也被廣泛采用。poly-A+RNA-seq是mRNA轉(zhuǎn)錄組分析常用的方法，而去除rRNA文庫與總RNA文庫是circRNA分析最常用的測序文庫。通過在測序結(jié)果中搜索嵌合reads(與基因組相比read的5’序列位于3’序列的下游)就可以檢測到circRNA。此外，還有其他一些檢測circRNA的算法。但是研究表明不同算法在circRNA檢測敏感性和特異性上存在很大差異，并且對假陽性率和假陰性率有顯著影響[16]。因此需要一個評估這些算法的金標(biāo)準(zhǔn)。此外?；蜷g、基因內(nèi)序列同源性會導(dǎo)致read與基因組的錯誤比對，因此對RNA線性或環(huán)形剪接的精確、敏感的檢測仍然是生物信息學(xué)面臨的一個難題。目前Rajewsky實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建了一個circRNA數(shù)據(jù)庫(circbase.org)。

3 circRNA的表達(dá)

越來越多的證據(jù)表明circRNA在真核細(xì)胞中發(fā)揮功能。在多種發(fā)育背景和細(xì)胞類型中均檢測到了circRNA，并且它們呈現(xiàn)動態(tài)表達(dá)，說明它們的表達(dá)是可調(diào)控的。

(1)circRNA表達(dá)的細(xì)胞及組織特異性

一些circRNA具有組織表達(dá)特異性，并且某一特定基因在不同細(xì)胞類型中產(chǎn)生的circRNA種類不同。例如來源于DCC基因的circRNA在人類不同組織中表達(dá)量存在很大差異。最近的許多研究也證實(shí)了這種現(xiàn)象，說明RNA環(huán)化調(diào)控的普遍性[17]。同時，其他研究也發(fā)現(xiàn)了circRNA的表達(dá)與mRNA水平并沒有相關(guān)性。多個研究小組報(bào)道，在人、小鼠、豬腦組織中，circRNA具有很高的豐度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅、小鼠腦組織表達(dá)的circRNA被富集到了編碼神經(jīng)元蛋白和突觸因子的基因，說明circRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)或許發(fā)揮功能[18-19]。

(2)circRNA表達(dá)的保守性

circRNA在哺乳動物中呈現(xiàn)出表達(dá)保守性。也就是說同源circRNA在不同哺乳中具有類似的表達(dá)(量/性)。有關(guān)circRNA保守性的研究主要是在人和小鼠circRNA表達(dá)的比較上。據(jù)估計(jì)大約5%～30%小鼠circRNA與人類具有同源性。最近研究發(fā)現(xiàn)大約15%～20%的小鼠腦組織circRNA與豬腦組織circRNA具有同源剪接位點(diǎn)。豬與人circRNA具有中度保守性，5%～10%的人類腦組織circRNA在豬腦組織中表達(dá)。這些結(jié)果間的差異極有肯能是由于測序深度(測序深度低就無法檢測到低豐度circRNA的表達(dá))、保守性的統(tǒng)計(jì)學(xué)定義、生物信息學(xué)參數(shù)設(shè)定、組織樣本不同造成的。

circRNA在所有真核生物中均被檢測到，包括在真核微生物。值得注意的是裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)和發(fā)面酵母(Saccharomyces cerevisiae)也檢測到了circRNA，但是這兩種真菌僅具有有限的可變剪切事件[20]。這些發(fā)現(xiàn)表明circRNA是基因表達(dá)的一種古老特性或者是在真核進(jìn)化過程中獨(dú)立出現(xiàn)。

在發(fā)育過程中circRNA表達(dá)呈現(xiàn)了動態(tài)變化。例如，在人和果蠅胚胎發(fā)育過程中circRNA被誘導(dǎo)表達(dá)。circSYR是circRNA發(fā)育調(diào)控表達(dá)最經(jīng)典的例子之一，此處不再詳述。

(3)circRNA表達(dá)調(diào)控因子

在發(fā)育過程中circRNA的細(xì)胞特異剪接和動態(tài)表達(dá)使人們聯(lián)想到了調(diào)控circRNA合成和降解的順式作用元件。RNA結(jié)合蛋白(RBP)是調(diào)控pre-mRNA剪接的主要順式作用元件，因此研究人員將重點(diǎn)放在了鑒定調(diào)控circRNA剪接的RBP上。

首個被鑒定出調(diào)控circRNA表達(dá)的RBP是果蠅Muscleblind protein(MBL)[21-22]。MBL是果蠅肌肉和光感受器發(fā)育所必須的，敲除該基因是胚胎致死的。作為circRNA的調(diào)控因子，MBL能夠促進(jìn)MBL pre-mRNA第二外顯子剪接成circRNA(circMBL)，circMBL是果蠅頭部表達(dá)量最高的circRNA之一。據(jù)推測circMBL能競爭性地抑制MBL mRNA的產(chǎn)生，因而以一種負(fù)反饋樣的調(diào)節(jié)機(jī)制降低MBL蛋白水平。circMBL上的MBL結(jié)合位點(diǎn)(具有高度保守性)可以吸附MBL蛋白，阻止其發(fā)揮功能。但是果蠅MBL并不能調(diào)控所有circRNA。最近對laccase2和PlexA基因的研究發(fā)現(xiàn)RNA環(huán)化是在hnRNP和SR蛋白共同作用下發(fā)生的。這些因子或許直接對pre-mRNA產(chǎn)生作用，或許通過其他因子間接作用。

人類ADAR家族成員與circRNA的產(chǎn)生有關(guān)。它們可以將配對的RNA中的腺嘌呤(A)轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤(I)[23]。環(huán)化外顯子的內(nèi)含子側(cè)翼序列中富集的Alu元件及配對堿基間的相互作用對circRNA的合成具有重要作用, 因而推測ADAR或許可以調(diào)控circRNA的產(chǎn)生[24]。特別是ADAR高表達(dá)會降低堿基配對的穩(wěn)定性，而這一穩(wěn)定性對circRNA的合成是必須的，這就導(dǎo)致了circRNA產(chǎn)量的減少。通過shRNA干擾ADAR的表達(dá)證實(shí)了這一推論(部分circRNA的表達(dá)量下降，而其他circRNA表達(dá)未發(fā)生變化)。這或許是由于ADAR與pre-mRNA直接作用的結(jié)果，因?yàn)樵赾ircRNA剪接位點(diǎn)存在A-I富集現(xiàn)象。但仍需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。此外，Quaking(QKI)也是調(diào)控circRNA產(chǎn)生的另一個RBP[25]。

4 circRNA的功能

盡管人們已經(jīng)認(rèn)識到了環(huán)狀RNA的豐富性，但環(huán)狀RNA的作用以及生物功能仍需要不斷地探索。目前，所認(rèn)識到環(huán)狀RNA的功能主要有以下幾個方面。

圖2 circRNA功能分類[3]

(A)circRNA具有許多miRNA/RBP結(jié)合位點(diǎn)，可以發(fā)揮吸附海綿的作用，競爭性結(jié)合miRNA/RBP, 改變基因表達(dá)；(B)EIciRNA(exon-intron circRNAs)通過與U1 snRNP結(jié)合而作用于轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，誘導(dǎo)基因表達(dá)。

(1)海綿作用(圖2A)

MiRNA是一類長度在21 nt左右的RNA，它們可以通過堿基互補(bǔ)配對直接與mRNA靶標(biāo)相結(jié)合，從而起到抑制mRNA翻譯的作用。由于環(huán)狀RNA擁有miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，因此環(huán)狀RNA可以通過吸附特定的miRNA，與靶基因競爭性結(jié)合miRNA，從而釋放miRNA對靶基因的抑制作用[26]。目前，研究比較比較充分的有兩個環(huán)狀RNA，ciRS-7/CDR1as和Sry circRNA。ciRS-7/CDR1as在哺乳動物的腦中表達(dá)非常豐富，擁有超過70個miR-7的結(jié)合位點(diǎn)，通過吸附miR-7使其活性大大降低。Sry circRNA是在小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)的一個高表達(dá)環(huán)狀RNA，擁有16個miR-138的結(jié)合位點(diǎn)，通過體外熒光素酶基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Sry circRNA可以抑制miR-138的活性。但環(huán)狀RNA是否普遍具有miRNA海綿作用還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

(2)調(diào)控轉(zhuǎn)錄(圖2B)

環(huán)狀RNA除了能夠吸附miRNA外，還可以與RNA結(jié)合蛋白(RBP)相結(jié)合形成 RNA蛋白復(fù)合物(RPCs)，對RNA結(jié)合蛋白和小RNA起調(diào)節(jié)作用或者通過部分堿基互補(bǔ)配對直接作用于靶基因[27-28]。2013年9月，科研人員發(fā)現(xiàn)許多細(xì)胞核內(nèi)circRNAs沒有或很少有miRNA結(jié)合位點(diǎn)，以circRNA ci-ankrd52和ci-sirt7為例，在敲低處理后，發(fā)現(xiàn)兩者的前體mRNA量均減少，表明細(xì)胞核內(nèi)的circRNAs可能參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[29]。后續(xù)報(bào)道也得到了相似的結(jié)果[21-22]。

盡管已知功能的circRNA數(shù)目在不斷增長，但仍有數(shù)以千計(jì)功能未知的circRNA。大多數(shù)circRNA可能具有單一功能，亦或是多個circRNA共同發(fā)揮某種功能。但也有可能是大部分circRNA僅僅是pre-mRNA剪接產(chǎn)生的噪音，不具有任何功能。circRNA的表達(dá)具有保守性和可調(diào)控性，但或許只是利用mRNA剪接的調(diào)控因子(具有保守的結(jié)合模式)。因?yàn)閏ircRNA的表達(dá)與它的主基因的表達(dá)是耦合的，所以利用一般方法很難探究其功能。進(jìn)一步加深對circRNA合成過程的認(rèn)識有助于利用基因組編輯技術(shù)特異性敲除circRNA。這將打開探究circRNA功能之門。此外，circRNA過表達(dá)載體也將應(yīng)用于circRNA敲除的補(bǔ)救實(shí)驗(yàn)?？紤]到circRNA的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)與降解，它們或許可以為一些基本的細(xì)胞生物學(xué)問題提供一些新思路。