陽荷不同極性部位體外抑菌活性研究

蔡依，郭百臻，徐津林，李肖，段金輝，阮金蘭，*

（1.武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢430223；2.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北武漢430073）

陽荷（Zingiber striolatum Diels）系姜科姜屬多年生草本植物，藥用其新鮮根莖的嫩芽，廣泛分布四川、貴州、廣西、湖北、湖南、江西、廣東等地；生于林蔭下、溪邊，海拔300 m～1 900 m。陽荷是野生蔬菜，一年種植多年生長，能經(jīng)受惡劣的環(huán)境磨煉，生命力極強(qiáng)，基本上無病蟲害，無須使用農(nóng)藥，且多地均有栽培。陽荷是食藥同源，嫩芽、莖果味道香甜，可直接烹飪食用，富含有豐富的膳食纖維、必需氨基酸、蛋白質(zhì)，具有抗菌、抗氧化、活血、化瘀、降血糖、治療痛經(jīng)等作用，藥用價(jià)值非常高[1]。資源豐富的天然藥物是活性化合物的天然寶庫，植物的抗菌能力是它們在物種繁雜的自然界中長期與各類細(xì)菌斗爭的結(jié)果，植物提取物中的黃酮、香豆素、多糖等均具有明顯的抗菌活性[2]?，F(xiàn)階段，國內(nèi)外對陽荷的研究主要集中在膳食纖維、紅色素、多糖和降血糖等方面[3-6]，陽荷粗提物及不同極性萃取物鮮有報(bào)道，本課題采用體外抑菌活性測定的方法，對我國民間藥食兩用的植物陽荷進(jìn)行了體外抑菌活性研究，為陽荷的體外抑菌活性提供理論研究，進(jìn)而為合理有效的利用天然藥用植物提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

陽荷：湖北省利川市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)公司，經(jīng)本課題組華中科技大學(xué)同濟(jì)藥學(xué)院阮金蘭教授鑒定為姜科姜屬植物陽荷（Z.striolatum Diels）的幼嫩芽苞。

1.2 菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella Pneumoniae）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）：武昌理工學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞室提供。

1.3 試劑與儀器

牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、氫氧化鈉、瓊脂、無水乙醇、石油醚（沸點(diǎn)60℃～90℃）、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碘硝基四唑紫：上海麥克林生化科技有限公司；鏈霉素：北京中農(nóng)濟(jì)興生物技術(shù)有限公司；濾紙片：通用電氣生物科技有限公司；精密pH試紙：上海三愛思試劑有限公司。

BMX-30R高壓滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；OHG-9073BS-Ⅲ生化培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SY-500旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；ME104E/02超凈工作臺(tái)：上海尚道儀器制造有限公司；0.5麥?zhǔn)媳葷峁埽荷虾V銳生物科技有限公司；SPX-150BSH-Ⅱ電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-S2恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.4 陽荷乙醇提取物及不同極性萃取物的制備

將新鮮陽荷洗凈于60℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干，打粉，過40目篩，70%乙醇回流提取陽荷粉末，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇至無醇味，得乙醇提取物，乙醇提取物與水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收有機(jī)溶劑，得到陽荷乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物，經(jīng)真空干燥后密封保存于4℃[7]。

1.5 培養(yǎng)基的制備

量取1 L純化水于燒杯中，依次加入牛肉膏3.0 g、氯化鈉5.0 g、瓊脂15 g、蛋白胨10 g，加熱溶解，用精密pH試紙測定pH值，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.2，分裝于錐形瓶中，103.43 kPa和121℃高壓滅菌20 min，4℃冷藏備用[8]。

1.6 菌種的活化

將固體培養(yǎng)基平鋪于培養(yǎng)皿，用劃線法將菌種接種于培養(yǎng)皿中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌種生長狀態(tài)，所有操作均在無菌條件下操作。

1.7 菌懸液的制備

將已接種的單一菌落與液體培養(yǎng)基混合均勻，制備成菌懸液，將菌懸液與麥?zhǔn)媳葷峁鼙容^，使菌懸液的密度為1.5×108CFU/mL[9]，于4℃冷藏保存，備用，所有操作均在無菌條件下操作。

1.8 抗菌初篩樣品的制備

分別精密稱取陽荷乙醇提取物及各萃取物1.0 g和 0.5 g，用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解樣品，配制成高低濃度分別為0.1 g/mL和0.05 g/mL的供試樣品。

1.9 抑菌活性初篩（濾紙片法）

將直徑為6 mm的濾紙片分別浸泡于樣品溶液、空白對照溶液（DMSO溶液）和陽性對照溶液（鏈霉素溶液）中，取 200 μL 密度為 1.5×108CFU/mL 的菌懸液均勻涂布在固體培養(yǎng)基上，室溫放置至無明顯液體流動(dòng)，將濾紙片貼片在固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈，每個(gè)樣品重復(fù)測定4次，所有操作均在無菌條件下操作[10]。

1.10 最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）樣品的制備

初篩后具有抑菌活性的供試樣品用二倍稀釋法稀釋成不同濃度，依次為 25、12.5、6.25、3.125 mg/mL，4℃冷藏備用。

1.11 最低抑菌濃度（MIC）的測定

在96孔板中，第一列至第十列為供試樣品孔，第十一列為空白對照孔，第十二列為陽性對照孔，樣品孔每孔加入100 μL液體培養(yǎng)基，50 μL初篩后的樣品，加入50 μL菌液，用搖床在37℃搖勻，用含10%DMSO的液體培養(yǎng)基做空白對照和0.1 g/L的鏈霉素溶液做陽性對照，每個(gè)濃度均設(shè)3個(gè)復(fù)孔做平行對照，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入40 μL 0.2 g/L的碘硝基四唑紫，以微孔中是否出現(xiàn)紫色來檢查有無細(xì)菌生長，以不出現(xiàn)紫色的微孔濃度為最低抑菌濃度[11]，所有操作均在無菌條件下操作。

1.12 最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的測定

將未出現(xiàn)紫色的微孔濃度樣品取出200 μL，均勻涂步在固體培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，未出現(xiàn)菌落的即為MBC值，所有操作均在無菌條件下操作[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇提取物及各極性萃取物的抗菌作用

本試驗(yàn)選用了4種革蘭氏陰性菌（肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌）和4種革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌），對陽荷的乙醇提取物、石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物進(jìn)行體外抑菌活性試驗(yàn)，抗菌結(jié)果見表1。

表1 陽荷乙醇提取物及各萃取物的抑菌圈直徑（±s，n=4）Table 1 The dismeter of inhibition zone of extract and ethanol extract of Z.striolatum Diels（±s，n=4）

表1 陽荷乙醇提取物及各萃取物的抑菌圈直徑（±s，n=4）Table 1 The dismeter of inhibition zone of extract and ethanol extract of Z.striolatum Diels（±s，n=4）

注：-表示未檢出。

陽荷乙醇提取物及各萃取物對蘇云金桿菌均無抑菌活性；乙醇提取物對鮑曼不動(dòng)桿菌抑菌效果顯著；石油醚萃取物相比較于其他相，對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌抑菌活性較強(qiáng)，能顯著抑制細(xì)菌的生長繁殖，與乙醇提取物的抑菌活性相當(dāng)；乙酸乙酯萃取物對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果較強(qiáng)，對鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌有抑菌圈，但是無MBC值；正丁醇萃取物對鮑曼不動(dòng)桿菌抑菌效果較強(qiáng)，僅次于石油醚萃取物，對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有抑制效果，對其他菌均無MBC值；水萃取物對金黃色葡萄球菌抑菌圈數(shù)值最大，但是沒有MBC值，對肺炎克雷伯菌、枯草芽孢桿菌和糞腸球菌有較好的抑菌效果，對鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌沒有MBC值；空白對照無抑菌圈。

2.2 MIC值的測定

陽荷乙醇提取物及各萃取物對7種菌的最低抑菌濃度見表2。

表2 陽荷乙醇提取物及各萃取物的最低抑菌濃度Table 2 The minimum inhibitory concentration of extract and ethanol extract of Z.striolatum Diels

5個(gè)供試樣品均對肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌有顯著的抑制作用，其中石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌抑菌效果十分顯著，MIC值達(dá)到了3.125 mg/mL。

2.3 MBC值的測定

陽荷乙醇提取物及各萃取物對7種菌的最低殺菌濃度見表3。

表3 陽荷乙醇提取物及各萃取物的最低殺菌濃度Table 3 The minimum bactericidal concentration of extract and ethanol extract of Z.striolatum Diels

陽荷乙醇提取物及各萃取物對肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的最低殺菌濃度均為25 mg/mL，乙醇提取物和石油醚萃取物殺菌效果較其他相優(yōu)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對陽荷乙醇提取物及不同極性萃取物進(jìn)行體外抑菌活性研究，試驗(yàn)結(jié)果表明乙醇提取物和石油醚萃取物相比較于乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物對肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、糞球腸菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌生長抑制作用更明顯，石油醚萃取物對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和糞腸球菌的抑菌效果優(yōu)于乙醇提取物，由此可見，抑菌活性部位主要為乙醇提取物和石油醚萃取物，即脂溶性成分作用明顯，且經(jīng)過萃取的石油醚萃取物作用較乙醇提取物作用更顯著[13]。陽荷乙醇提取物及不同極性萃取物對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制作用，顯示出廣譜抑菌活性。后續(xù)試驗(yàn)可以將陽荷脂溶性部位分離、純化，研究陽荷抑菌有效成分、作用機(jī)制，將陽荷的有效抑菌成分與市面上現(xiàn)有的食品防腐劑比較保鮮性能。為具有抑菌功能的天然、無毒的食品添加劑或者食品防腐劑提供理論試驗(yàn)依據(jù)。