高產(chǎn)鐵載體產(chǎn)生菌的篩選及其在發(fā)酵綠茶中的初步應(yīng)用

李韻雅 ， 曹剛剛 ， 蔡宇杰 ， 廖祥儒 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

茶含豐富營養(yǎng)物質(zhì)，具多種保健功能，是一種廣泛適用的飲品。茶葉中研究最多的幾種生物活性成分有茶多酚 （tea polyphenol）、 茶多糖（tea polysaccharide）和咖啡堿（caffeine）。 茶多酚是包括黃烷醇類、黃烷酮類、花色苷類和酚酸類等在內(nèi)的約30多種含酚基的物質(zhì)；黃烷醇類是茶多酚的主要存在形式，而兒茶素類化合物是黃烷醇類的主要成員，因此在茶葉中茶多酚大部分都以兒茶素的形式存在[1]。茶多酚不僅是一種天然的抗氧化劑，還具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌抗突變、抗動脈粥樣硬化、抗輻射、防止糖尿病等廣泛的生理功能。茶多糖主要包括葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、核糖、半乳糖、木糖及甘露糖等。茶多糖是一種水溶性復(fù)合多糖，相對分子質(zhì)量約為 l×l04～5×104，茶葉中提取的茶多糖產(chǎn)品常含有少量的蛋白質(zhì)、果膠等物質(zhì)[2]。茶多糖具有抗血栓、增強免疫功能、降血糖、降血脂、抗凝血等多種生物活性。茶葉中咖啡堿含量約占干物質(zhì)量的2%～5%[3]?？Х葔A能興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)，還可以起到解熱鎮(zhèn)痛、助消化、利尿的作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化工行業(yè)。

雖然茶葉中這些物質(zhì)功能多樣，但是攝入過多則對健康不利，如茶多酚攝入過多會刺激胃部。發(fā)酵過程中茶多酚被氧化，茶葉本身的酚氨比降低、芳香物質(zhì)增加，同時酚氨比的降低也可以增強茶湯口感的協(xié)調(diào)性[4]。經(jīng)過不同微生物發(fā)酵還可以改善茶的口感或風(fēng)味，做成不同品種的發(fā)酵茶。細菌、霉菌和食用菌都可以應(yīng)用于茶葉的發(fā)酵。在普洱茶研究中發(fā)現(xiàn)接種有益菌進行茶葉發(fā)酵有利于茶葉優(yōu)良品質(zhì)及特定風(fēng)味的形成[5-8]。也有研究人員采用多菌種混合發(fā)酵和不同菌種分階段發(fā)酵的工藝。胡燕等[9]以茶葉浸提液為主要基質(zhì)，對用乳酸菌發(fā)酵茶飲料的加工工藝進行優(yōu)化，在工藝條件優(yōu)化后制得的茶飲料，既有茶的各種風(fēng)味物質(zhì)和營養(yǎng)成分，又增加了酸奶的營養(yǎng)成分，使其風(fēng)味好、品質(zhì)佳。江潔等[10]采用乳酸菌和酵母菌進行兩段發(fā)酵，發(fā)酵后茶湯既有乳酸菌飲料的風(fēng)味和保健特征，又具酵母發(fā)酵的醇香。日本的發(fā)酵茶也是一種混菌多菌種分段發(fā)酵的茶飲料，其生產(chǎn)工藝是在茶飲料中先接種Aspergilus fumigatus，Aspergillus nigerm，Penicillium sp.，Seopulariopsis brcvicaulis， 發(fā)酵一段時間后，茶葉基質(zhì)中纖維素和果膠等被消化破壞，茶中營養(yǎng)物質(zhì)易溶出，再接種Laetobacillus plantarum，繼續(xù)發(fā)酵，即制成了一種氨基酸含量較高的發(fā)酵茶飲料[11]。

當處于低鐵脅迫環(huán)境時，為了滿足微生物生長對鐵的需求，微生物能夠分泌鐵載體用以形成鐵螯合物，以有效吸收自然中溶解度很低的鐵[12]。鐵載體類型主要為氧肟酸鹽型（hydroxamates）、兒茶酚鹽型（phenolatescatecholates） 和羧酸鹽型（carboxylates）等。臨床上，鐵載體可用于鐵中毒或作為毒力因子治療細菌疾病，還能夠與抗生素結(jié)合形成共軛化合物，從而將抗生素傳遞給細菌細胞[13-15]。鐵載體可以改善人體對鐵的吸收，在健康保健方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

作者研究的目的是篩選鐵載體高產(chǎn)菌株，并將其應(yīng)用到綠茶發(fā)酵，在實現(xiàn)常用的茶葉發(fā)酵菌株的改善茶葉品質(zhì)的效果的同時提高發(fā)酵茶的營養(yǎng)價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

1.1.1 主要材料 茶葉：市售低檔綠茶；菌種：作者所在實驗室保存的蘇鐵根際芽孢桿菌。

1.1.2 主要試劑 CAS（鉻天青），F(xiàn)eCl3，CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），亞硝酸鈉，鉬酸鈉，2,3-二羥基苯甲酸，NaOH，HCl等試劑：購自國藥集團;API 50CHB鑒定試劑條：購自生物梅里埃有限公司;細菌基因提取試劑盒：購自寶生物工程有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨10.0，酵母膏 5.0，NaCl 10.0，瓊脂 15.0；pH 7.0。

CAS雙層平板：下層10 mL CAS-Fe3+-CTAB固體檢測液，CAS濃度為 1 mmol/L，F(xiàn)e3+濃度為 0.1mmol/L，CTAB 濃度為 4 mmol/L，瓊脂 20 g/L；上層10 mL固體LB培養(yǎng)基。

LB 培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨 10.0，酵母膏 5.0，NaCl 10.0：pH 7.0。

KMB 培養(yǎng)基（g/L）：甘油 9.0 mL，K2HPO42.5，MgSO4·7H2O 2.5，酪蛋白氨基酸 5.5；pH 自然。

以上培養(yǎng)基均經(jīng)過115℃滅菌20 min。

1.2 分析方法

1.2.1 菌種鑒定 采用16S rRNA基因序列分析法，按試劑盒說明提取細菌DNA并以通用引物F27（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ ） 和 R1492（5’-TACGGCTACCTTGTTA CG ACTT-3’ ）擴增細菌16S rRNA基因，純化測序。

1.2.2 鐵載體類型鑒定鐵載體類型鑒定 主要根據(jù)螯合鐵離子集團的不同及其與不同試劑的不同顯色進行鑒定[16]。

1）高氯酸鐵實驗：取發(fā)酵上清液0.5 mL加入2.5 mL的高氯酸鐵溶液，若顏色變成紅色或者橙色，則說明發(fā)酵上清液中含有異羥肟酸類鐵載體。

2）FeCl3實驗：取發(fā)酵上清液1 mL加入1～5 mL 2 g/L的FeCl3溶液，如果顏色變紅或變紫說明有鐵載體的存在。1 mL上清液加入1 mL FeCl3溶液立即變紅的，則為異羥肟酸類鐵載體，1 mL上清液加入多于1 mL FeCl3溶液，溶液變紅或變紫，則為兒茶酚類鐵載體。

3）Arnow實驗：取發(fā)酵上清液1 mL，依次加入1 mL 0.5 mol/L鹽酸，1 mL鉬酸鹽溶液，若上清液中存在兒茶酚型鐵載體，則溶液中的亞銷酸分解，生成黃色NO配體，溶液顏色變黃。

鉬酸鹽溶液配制：稱取硝酸鈉10 g與鉬酸鈉10 g溶解于100 mL蒸餾水中。

因為亞硝酸在溶液中的分解迅速不利于黃色配體的生成，因此，在溶液中加入鉬酸鈉，可使亞硝酸分解減慢。鉬酸鈉加入后還可提高顯色的亮度達15倍。

加入1 mol/L的氫氧化鈉溶液1 mL，若含有兒茶酚類鐵載體，則顏色變紅，而且至少能夠保持一個小時不變色。

1.2.3 鐵載體濃度測定 實驗方法依據(jù)參考文獻［16］采用Arnow實驗進行定量，方法略有改動。

標準曲線繪制：配置1 mmol/L的2，3-二羥基苯甲酸溶液。將其分別稀釋使?jié)舛确謩e為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mmol/L。 取上述各濃度梯度的2，3-二羥基苯甲酸溶液1 mL于試管中，依次加入1 mL 0.5 mol/L鹽酸，1 mL 1 mol/L鉬酸鈉溶液，1 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，混合均勻，靜置1 h，檢測OD515。

取1 mL發(fā)酵上清液，加入1 mL 0.5 mol/L鹽酸，1 mL 1 mol/L鉬酸鈉，1 mL 1 mol/L氫氧化鈉，混合均勻，靜置1 h，檢測OD515。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種篩選 CAS平板初篩：將實驗室保存的69株蘇鐵根際芽孢桿菌分別接種到LB平板，30℃培養(yǎng)3 d。挑取菌落接種到CAS雙層平板，繼續(xù)在30℃培養(yǎng)3 d。

鐵載體高產(chǎn)株篩選：選取CAS雙層平板中變色圈大的菌株作為初篩菌株，接種到LB培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)3 d得到種子液。按體積分數(shù)1%接種種子液至50 mL KMB培養(yǎng)基中，30℃、200 r/min培養(yǎng)3 d。離心得到上清液。再用Aronw實驗測定鐵載體的濃度。選取產(chǎn)高鐵載體的菌株接種斜面保存。

1.3.2 茶葉的品鑒 茶葉的感官評價根據(jù)國家標準GB/T 23776-2009《茶葉感官審評方法》中普通（大宗）綠茶的評審方法執(zhí)行。茶的品鑒得分根據(jù)下式（1）計算得出（單項滿分100分）：

式中，A1為外形得分，A2為湯色得分，A3為香氣得分，A4為滋味得分，A5為葉底得分。

1.3.3 綠茶發(fā)酵條件優(yōu)化 發(fā)酵溫度與時間是影響發(fā)酵茶品質(zhì)的主要因素[17-18]，而本實驗中菌種為新的外加菌種，所以選取溫度、接種量和時間3個條件進行優(yōu)化。

發(fā)酵溫度和接種量：每瓶放入5 g茶葉，選取發(fā)酵溫度和接種量2個因素做正交實驗，因素和水平見表1，發(fā)酵7 d后進行感官評價。

發(fā)酵時間的優(yōu)化：取5 g綠茶，接種2.5 mL種子液后于40℃培養(yǎng)7～13 d，品鑒茶葉。

表1 L9（32）正交優(yōu)化設(shè)計因素水平表Table 1 Orthogonal design

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種篩選和鑒定

2.1.1 CAS雙層平板初篩 鐵載體結(jié)合CAS-Fe3+-CTAB藍色復(fù)合物中的Fe3+，復(fù)合物解體平板顯現(xiàn)出CAS原有的黃色[19]。故可根據(jù)平板變色圈的大小判斷菌株是否產(chǎn)生及產(chǎn)鐵載體能力的強弱。取自蘇鐵根部的土壤涂板得到69株菌，接種69株菌到CAS平板，得到8個能夠產(chǎn)生鐵載體的菌株，編號分別為：11，15，36，50，86，142，168，169，見圖 1。

2.1.2 初篩菌種產(chǎn)鐵載體類型鑒定 初篩得到的8株菌的鐵載體類型檢測結(jié)果見表2，可知其主要產(chǎn)生的鐵載體類型為兒茶酚鹽型。

2.1.3 茶葉發(fā)酵初試及產(chǎn)鐵載體能力檢測 上述8個菌株接種種子液到茶葉進行固態(tài)發(fā)酵，然后對發(fā)酵茶進行感官評審；接種菌株到KMB培養(yǎng)基發(fā)酵后測定鐵載體濃度，結(jié)果見表3。

圖1 CAS雙層平板初篩結(jié)果Fig.1 Isolation of strains on CAS plates

表2 鐵載體類型檢測結(jié)果Table 2 Siderophore type test results

表3 初篩菌株茶葉發(fā)酵初試結(jié)果及產(chǎn)鐵載體能力檢測結(jié)果Table 3 Tea fermentation test and produce siderophores test results of the frist screenedStrains

品鑒不同菌株發(fā)酵后茶葉的品質(zhì)，得到15、36、142、169四株菌發(fā)酵后茶葉品質(zhì)較好，都在70分以上。36、169兩株菌鐵載體產(chǎn)量較高。綜合不同菌株發(fā)酵后茶葉感官和鐵載體產(chǎn)量，選取36號菌為后續(xù)實驗菌株。

2.1.4 菌種鑒定 16S rRNA基因鑒定，將測得序列進行BLAST比對，根據(jù)結(jié)果，取序列相似度較高的模式菌株，使用Clustalx1.81和MEGA 4.0.2軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining method）進行聚類分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建，結(jié)果見圖2。目的菌株36的16S rRNA基因序列與芽孢桿菌屬特基拉細菌的16S rRNA基因序列最為接近。

菌36平板菌落形態(tài)如圖3所示，其菌落較小，白色不透明，邊緣光滑，表面呈傘狀凸起，較粘稠、易挑取。目的菌糖發(fā)酵生理生化鑒定見表4。目的菌初步鑒定為細菌界、硬（或厚）壁菌門、芽孢桿菌綱、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科、特基拉芽孢桿菌屬。

圖2 基于16S rRNA基因序列對目的菌株構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the target strain based on its 16S rRNA gene analysis

圖3 目的菌平板菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology on plate of the target strain

2.2 綠茶發(fā)酵優(yōu)化

2.2.1 發(fā)酵溫度和接種量 茶葉發(fā)酵溫度和接種量的正交實驗結(jié)果見表5?？芍瑴囟葘Σ枞~感官的影響大于接種量。接種量加大時細菌發(fā)酵產(chǎn)生的酸臭味增加，但這種酸臭味在干燥過后并不明顯。溫度升高可去除茶葉中部分雜味，但高溫長時間發(fā)酵有可能給茶葉帶來焦糊味，影響茶葉香氣和口感。此次優(yōu)化實驗得到發(fā)酵溫度40℃、接種量0.5 mL/g時發(fā)酵茶感官評價最高。發(fā)酵后茶湯苦澀味減少，口感協(xié)調(diào)性增加。

表4 API 50 CHB試劑盒對應(yīng)底物及目的菌反應(yīng)Table 4 The substrates corresponding to API 50 CHB kits and the strain reaction

表5 茶葉發(fā)酵溫度與接種量正交實驗分析表Table 5 Orthogonal experiment analysis table of fermentation temperature and inoculum

2.2.2 發(fā)酵時間 發(fā)酵茶感官分數(shù)在第5天時最高，這時茶葉口感渾厚淳正，無苦澀味；香氣怡人，雜味極少；色澤紅亮澄清；葉底舒展較快，形狀完整。茶湯中鐵載體濃度因為發(fā)酵過程中多酚類物質(zhì)的降解而降低。

圖4 不同發(fā)酵時間茶葉指標Fig.4 Indicator diagram of tea with different fermented time

3 結(jié)語

“渥堆”發(fā)酵是熟茶（后發(fā)酵茶）加工的特定加工工藝，渥堆的實質(zhì)是一個多種微生物參與的固態(tài)發(fā)酵過程，是茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵，微生物在其中起到極其重要的作用，目前采用專用菌曲生產(chǎn)熟茶已成為一種趨勢[20]。本實驗中，將篩選的一株特基拉芽孢桿菌應(yīng)用到茶葉固態(tài)發(fā)酵，有效改善了茶葉的風(fēng)味，尤其在茶葉香氣方面，發(fā)酵后的茶獲得了淡淡果香，且茶葉品質(zhì)易再現(xiàn)。說明應(yīng)用有益微生物進行可控發(fā)酵，可達到穩(wěn)定茶葉品質(zhì)形成獨特風(fēng)味的目的[21-22]。目的菌株具有分泌鐵載體的功能，有報道顯示鐵載體在再灌注損傷、鐵粒幼細胞貧血、鐵過載心肌病等疾病的治療和肝細胞保護等人體保健方面具有潛力[23-25]，但其對于發(fā)酵茶的保健效果是否增加仍需進一步驗證。本研究中所用菌種是從蘇鐵根際菌中篩選得到的，屬芽孢桿菌屬。有研究證明多種芽孢桿菌在普洱茶發(fā)酵渥堆過程中起到至關(guān)重要的作用，也有將芽孢桿菌分離作為單菌種接種發(fā)酵茶[26-28]。雖然芽孢桿菌屬細菌能廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[29]，但本研究中發(fā)酵產(chǎn)品安全性仍有待進一步驗證。

作者對目的菌株進行了16S rRNA和糖發(fā)酵生理生化指標的研究，初步鑒定該菌為芽孢桿菌屬中的特基拉芽孢桿菌。在鐵載體產(chǎn)量分析上，CAS試劑配制中加入的CTAB對菌體生長有抑制作用[30]，故作者采用的CAS雙層平板使菌體利用上層LB培養(yǎng)基進行生長，而細菌所分泌的鐵載體進入下層形成明顯的變色圈，較參考文獻[16]中的通用CAS平板更有利于對鐵載體產(chǎn)量的判斷。根據(jù)不同菌種生長需求常采用雙層平板法或添加其他營養(yǎng)物質(zhì)對通用CAS平板檢測方法進行改進[31-32]。鐵載體不僅可給產(chǎn)生菌自身提供可利用的鐵源，過量的鐵載體還能形成相對高鐵濃度的小環(huán)境，有利于可利用同源鐵載體的植物的生長，并抑制某些不能利用其鐵載體的細菌（如病原菌）的生長[33-34]。由于鐵載體也能螯合其他多種重金屬，鐵載體產(chǎn)生菌也常用來研究其對土壤改善的作用[35]。因此該菌種還具有被應(yīng)用于植物促生、病原菌的防治及土壤改善等方面的潛力。