超早期針刺水溝穴對(duì)急性腦缺血大鼠紋狀體氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

于曉蕾,劉婧,毛群燕

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超早期針刺水溝穴對(duì)急性腦缺血大鼠紋狀體氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

于曉蕾1,劉婧2,毛群燕3

(1.浙江省桐廬縣中醫(yī)院,杭州 311500;.2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院,杭州 310005;3.浙江省龍游縣人民醫(yī)院,衢州 324400）

探討超早期針刺水溝穴對(duì)急性腦缺血大鼠的紋狀體細(xì)胞外液氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)大鼠均施行微透析套管埋置術(shù),并以線栓法構(gòu)建永久性大腦中動(dòng)脈閉塞(permanent middle cerebral artery occlusion, PMCAO)大鼠模型;隨機(jī)分為空白組、針刺組和模型組。針刺組予以針刺水溝穴,留針2 h;空白組和模型組不予任何干預(yù),同時(shí)運(yùn)用微透析技術(shù)對(duì)其紋狀體細(xì)胞外液分4個(gè)時(shí)段進(jìn)行微量透析取樣,并應(yīng)用高效液相色譜熒光法(high performance liquid chromatography with fraunhofer line discriminator, HPLC-FLD)監(jiān)測(cè)微透析樣品中谷氨酸(glutamic acid, Glu)、g-氨基丁酸(g-aminobutyric acid, GABA)含量的動(dòng)態(tài)變化。模型組4個(gè)時(shí)段透析液中Glu含量有上升趨勢(shì)(＜0.05);針刺組、空白組4個(gè)時(shí)段透析液中Glu含量相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。模型組和針刺組4個(gè)時(shí)段透析液中Glu含量均較空白組增加(＜0.05);針刺組4個(gè)時(shí)段透析液中Glu含量均較模型組下降(＜0.05)。空白組、模型組和針刺組4個(gè)時(shí)段透析液中GABA含量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。模型組和針刺組4個(gè)時(shí)段透析液中GABA含量均較空白組增加(＜0.05)。針刺組4個(gè)時(shí)段透析液中GABA含量與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。超早期針刺水溝穴可有效調(diào)節(jié)急性腦缺血大鼠紋狀體細(xì)胞外液氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)代謝紊亂,減少缺血缺氧誘發(fā)的Glu過度釋放,并維持GABA內(nèi)源性抑制作用。

針刺;穴,水溝;腦缺血超早期;谷氨酸;g-氨基丁酸;大鼠

腦卒中是當(dāng)今嚴(yán)重危害人類生命健康和影響生活質(zhì)量的主要公共衛(wèi)生問題[1-2]。我國的腦卒中疾病中,缺血性卒中占75%以上,特別是大腦中動(dòng)脈閉塞占血管閉塞的43%[3]。腦缺血急性期的干預(yù)治療對(duì)其預(yù)后具有決定性影響。目前,用于重新打開被阻塞血管的重組組織型纖溶酶原激活劑是治療急性腦缺血最有效的藥物,但由于其治療時(shí)間窗的限制只適于很少數(shù)患者[4-7]。所以,探究對(duì)腦缺血急性超早期簡(jiǎn)、便、廉、效的治療措施更值得關(guān)注。

局灶性腦缺血發(fā)生后,腦內(nèi)氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)生變化。興奮性氨基酸(excitatory amino acid, EAA)與抑制性氨基酸(inhibitory amino acid, IAA)相輔相成,協(xié)同運(yùn)作于大腦中樞系統(tǒng)。以Glu為代表的EAA所引起的神經(jīng)毒性作用既是腦組織損傷的啟動(dòng)者,又是執(zhí)行者,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的一系列病理反應(yīng);而以GABA為代表的IAA作為內(nèi)源性腦保護(hù)劑,具有拮抗神經(jīng)興奮毒性的作用。

針刺療法作為腦保護(hù)措施已被越來越普遍地應(yīng)用于腦缺血急性期治療,研究證實(shí),針刺可有效地增強(qiáng)缺血損傷后神經(jīng)元存活能力,減輕缺血損害程度,從而使預(yù)后得以改善[8-13]。基于急性腦缺血的治療時(shí)間窗及針刺干預(yù)急性腦缺血相關(guān)研究日漸成為研究重點(diǎn),人們?cè)絹碓街匾暢缙卺槾虒?duì)急性腦缺血的介入效應(yīng)。因此,本實(shí)驗(yàn)采用腦微透析聯(lián)合高效液相色譜熒光技術(shù)測(cè)定腦缺血急性超早期大鼠的紋狀體細(xì)胞外液氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量以研究針刺對(duì)腦缺血急性超早期干預(yù)的介入效應(yīng),為針刺干預(yù)腦缺血急性超早期提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性SD大鼠40只,體重250～270 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物每籠5只分籠飼養(yǎng),飼養(yǎng)溫度維持在25℃左右,自由攝食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)后,開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要儀器及試劑

腦立體定位儀(型號(hào)68002),深圳市瑞沃德生命科技有限公司;激光多普勒血流儀(PeriFlux5000),瑞典PERIMED公司;微透析系列,日本Eicom公司;高效液相系列,美國安捷倫公司;谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品,美國安捷倫公司;g-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

取250～270 g成年SD雄性大鼠40只,隨機(jī)選取5只大鼠為空白組,其余為造模大鼠。全部動(dòng)物均施行微透析套管埋置術(shù),待修復(fù)3 d后,造模大鼠施線栓法閉塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈構(gòu)建PMCAO模型。PMCAO模型復(fù)制成功后隨機(jī)分成模型組和針刺組。

1.2.2 微透析套管埋置術(shù)

將麻醉后大鼠固定于腦立體定位儀,充分暴露大鼠顱骨,將微透析套管埋置在紋狀體(LB:9.0 mm、AP:﹢1.5 mm、ML:﹢2.8 mm、V:﹣4.0 mm),并將激光多普勒探頭基座黏置在以AP:﹣3.0 mm、ML:﹢5.0 mm為中心[14]的顱骨表面,并埋置螺絲釘以加強(qiáng)固定。

1.2.3 PMCAO模型制備

PMCAO模型制備參照Longa線栓造模方法,并進(jìn)行部分改良[15-19]。采用異氟烷吸入麻醉(動(dòng)物吸入麻醉機(jī),型號(hào)VMR,美國MATRX),應(yīng)用激光多普勒血流儀(Laser Doppler Flowmetry, LDF)監(jiān)測(cè)基礎(chǔ)腦血流,將大鼠取仰臥位固定于手術(shù)架上,充分暴露右側(cè)頸區(qū),清晰分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery, CCA),頸外動(dòng)脈(extemal carotid artery, ECA),頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery, ICA),枕動(dòng)脈(occipital artery, OA)。將右側(cè)CCA下端結(jié)扎;在右側(cè)CCA上端(近ECA與ICA交界處)進(jìn)行假性結(jié)扎,打一活結(jié);在右側(cè)ECA(OA)下端近“Y”形交叉處結(jié)扎;并用微動(dòng)脈夾夾閉右側(cè)ICA。在右側(cè)CCA活結(jié)與死結(jié)之間(“Y”形交叉處下約3 mm處)作切口;將前端浸蠟的魚線(直徑0.26 mm)插入此切口,待線栓頭插至ICA時(shí),將CCA上端活結(jié)結(jié)扎,然后緩慢松開夾閉ICA的微動(dòng)脈夾。繼續(xù)進(jìn)線16～18 mm至有輕微阻滯感[20-22],即線栓已插至大腦前動(dòng)脈近段,此深度恰好堵塞大腦中動(dòng)脈起始端口[23]。剪去多余魚線,逐層縫合皮膚。應(yīng)用LDF監(jiān)測(cè)PMCAO造模后腦血流,由于大腦中動(dòng)脈閉塞時(shí)局部微循環(huán)血流量可突然下降≥70%,待大鼠清醒后采用Bederson評(píng)分進(jìn)行神經(jīng)功能缺失評(píng)分(neurological deficit score, NDS)評(píng)定,0分為未見行為缺陷;1分為肢屈曲,即提尾懸空試驗(yàn)陽性;2分為側(cè)推抵抗力下降,即側(cè)向推力試驗(yàn)陽性,伴前肢屈曲,無轉(zhuǎn)圈行為;3分同2級(jí)行為,伴自發(fā)性旋轉(zhuǎn)。評(píng)分為2分及以上表明大腦中動(dòng)脈阻塞成功,即清醒后出現(xiàn)左前肢屈曲,站立不穩(wěn),前進(jìn)時(shí)向左側(cè)傾斜。大鼠局部微循環(huán)血流量變化和NDS評(píng)定相互驗(yàn)證,作為PMCAO模型是否成功的標(biāo)準(zhǔn)[24]。

1.2.4 處理

針刺組大鼠予以針刺水溝穴,針刺2 h;模型組和空白組不予任何干預(yù)。

1.2.5 取樣

對(duì)各組大鼠進(jìn)行處理的同時(shí),運(yùn)用腦微透析技術(shù)對(duì)其紋狀體細(xì)胞外液分4個(gè)時(shí)段進(jìn)行微量透析取樣, ①將微透析系統(tǒng)連接完整,將裝有灌流液的微量注射器安置于灌流注射泵上,將注射器針頭與轉(zhuǎn)環(huán)相應(yīng)入口、收集管針頭與轉(zhuǎn)環(huán)相應(yīng)出口分別用連接管接連,收集管針針頭插至收集裝置相應(yīng)孔道,收集裝置內(nèi)環(huán)境設(shè)置為4℃。灌流液成分為NaCl(147.0 mM)、KCl (4.0 mM)、CaCl2(2.3 mM)、MgCl2(1.0 mM)。②以2.0mL/min的速度進(jìn)行灌流,查驗(yàn)微透析連接是否完整、通暢。③透析前體外探針檢驗(yàn),小心緩慢取出探針,將其浸潤在裝滿超純水的離心管內(nèi)5 min,待其透析膜完全舒展,然后將浸潤在超純水中的探針入口端與微量注射器連接并以2.0mL/min的速度進(jìn)行灌流,若探針出口端順暢地有水珠流出,則示其透析膜良好完整,可備待用。④正式微透析取樣,在異氟烷呼吸麻醉狀態(tài)下將探針插入大鼠顱骨微透析套管內(nèi)。將各組大鼠連接微透析系統(tǒng),待1 h的探針平衡后正式透析取樣。其中,針刺組在造模成功后予針刺水溝穴,針刺同時(shí)以2.0mL/min的速度進(jìn)行為時(shí)2 h共4個(gè)階段(0～0.5 h、0.5～1 h、1～1.5 h、1.5～2 h)的透析取樣;空白組和模型組大鼠不予任何干預(yù),同針刺組相同時(shí)間及條件下進(jìn)行微量透析取樣。

1.2.6 檢測(cè)

應(yīng)用高效液相色譜熒光法監(jiān)測(cè)微透析樣品中Glu、GABA含量的動(dòng)態(tài)變化。

①試劑配備,流動(dòng)相A:將14.32 g的Na2HP04溶于900 mL超純水中,定容至1000 mL,再用H3P04調(diào)pH值至7.8;流動(dòng)相B:將450 mL甲醇和450 mL乙腈共溶于100 mL超純水中;將鄰苯二甲醛(OPA)分裝至離心管,50mL/管;備用。②色譜條件/氨基酸衍生,FLD波長(zhǎng)(Ex/Em)為250/410;PMT為10;柱溫為40℃;流動(dòng)相A/B=100/0,梯度洗脫0～1.9 min;流動(dòng)相A/B=61/39,梯度洗脫1.9～10 min。③進(jìn)樣程序:以最大速度(200mL/min)從硼酸鹽緩沖液樣品中吸取2.5mL,再從待測(cè)物樣品瓶中吸取0.5mL樣品,在空氣中混合3mL,等待0.5 min,共2次,將針頭置入超純水的樣品瓶中進(jìn)行清洗,以最大速度(200mL/min)從放有OPA衍生劑的樣品瓶中吸取0.5mL進(jìn)行衍生,在空氣中混合3mL,共6次,超純水中清洗針頭,在另一瓶超純水中吸入32mL的超純水后進(jìn)樣。各流動(dòng)相流速為2 mL/min,單個(gè)樣品10 min。④樣品檢測(cè):取50mLOPA、100mL硼酸鹽緩沖液(放入內(nèi)插管)和2 mL超純水(2瓶)放入相應(yīng)樣品瓶中,取微透析所得樣品(即透析液)放入帶有內(nèi)插管的樣品瓶中,按上述設(shè)定的程序進(jìn)行檢測(cè)。⑤繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:將Glu和GABA標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成0.02 nmol/mL、0.01 nmol/mL、0.005 nmol/mL、0.0025 nmol/mL、0.00175 nmol/mL,進(jìn)樣。根據(jù)高效液相峰面積繪制曲線。⑥樣品出峰時(shí)間:在上述色譜條件下,樣品中Glu出峰時(shí)間為1.03 min,GABA出峰時(shí)間為9.1 min。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用重復(fù)測(cè)量的方差分析對(duì)各組組內(nèi)、組間以及組內(nèi)和組間交互作用進(jìn)行比較。各組組內(nèi)因素的分析采用重復(fù)測(cè)量的方差分析,兩兩時(shí)間段比較采用檢驗(yàn)進(jìn)行分析,當(dāng)校正系數(shù)Epsilon＜0.7時(shí)選擇Bonferron Ⅰ法進(jìn)行兩兩比較。各時(shí)間段上組間比較采用多因素方差分析,兩兩比較采用檢驗(yàn)進(jìn)行分析。以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

PMCAO模型復(fù)制成功大鼠,即PMCAO術(shù)前與術(shù)后局部微循環(huán)血流量變化百分比≥70%且NDS≥2分的大鼠,共32只。PMCAO模型復(fù)制成功的32只大鼠中,經(jīng)灌注取腦后證實(shí)探針埋置位置準(zhǔn)確,且無腦出血現(xiàn)象的大鼠,模型組16只,針刺組12只。最終,對(duì)空白組(5只)、模型組(16只)、針刺組(12只)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2.1 針刺水溝對(duì)PMCAO大鼠紋狀體微透析液中Glu含量的影響(見表1)

結(jié)果顯示,模型組組內(nèi)因素存在效應(yīng)(=6.044,＜0.05),模型組微透析液中Glu含量隨時(shí)間變化呈上升趨勢(shì);而空白組和針刺組組內(nèi)因素?zé)o明顯差異(＞0.05),表明空白組和針刺組微透析液中Glu含量不隨時(shí)間變化而改變。

結(jié)果顯示,組間因素存在效應(yīng)(=4.576,＜0.05),表明各組微透析液中Glu含量存在差異性。在相同時(shí)間段上各組間微透析液中Glu含量進(jìn)行兩兩比較結(jié)果顯示,模型組和針刺組在0～0.5 h、0.5～1 h、1～1.5 h、1.5～2 h4個(gè)時(shí)間段Glu含量均高于空白組(＜0.05),針刺組在0～0.5 h、0.5～1 h、1～1.5 h、1.5～2 h4個(gè)時(shí)間段Glu含量均低于模型組(＜0.05)。

表1 各組大鼠紋狀體微透析液中Glu含量 (±s,×10﹣7mmol/L)

注:與同組前一時(shí)段比較1)＜0.05;與空白組比較2)＜0.05;與模型組的比較3)＜0.05

2.2 針刺水溝對(duì)PMCAO大鼠紋狀體微透析液中GABA含量的影響(見表2)

結(jié)果顯示,空白組、模型組、針刺組組內(nèi)因素均無明顯變化效應(yīng)(＞0.05),表明各組微透析液中GABA含量不隨時(shí)間變化而改變。

結(jié)果顯示,組間因素存在效應(yīng)(=4.778,＜0.05),表明各組微透析液中GABA含量存在差異性。在相同時(shí)間段上各組間微透析液中GABA含量進(jìn)行兩兩比較結(jié)果顯示,模型組和針刺組在0～0.5 h、0.5～1 h、1～1.5 h、1.5～2 h4個(gè)時(shí)間段GABA含量均高于空白組(＜0.05);針刺組與模型組在0～0.5 h、0.5～1 h、1～1.5 h、1.5～2 h4個(gè)時(shí)間段組間因素?zé)o明顯差異(＞0.05)。

表2 各組大鼠紋狀體微透析液中GABA含量 (±s,×10﹣7mmol/L)

注:與空白組比較1)＜0.05

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選取水溝作為干預(yù)穴位,觀察其超早期針刺對(duì)急性腦缺血大鼠紋狀體細(xì)胞外液的氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響。水溝穴是中風(fēng)病急救穴,該穴歸屬督脈,而督脈為陽脈之海,所以水溝穴具有回陽救逆之功效;督脈“起于下極之俞,并于脊里,上至風(fēng)府,入屬于腦”,而腦為“真氣之所聚”而藏元神,所以水溝穴可通過督脈連屬于腦而疏通督脈之陽氣以醒腦神、開清竅;又水溝穴位于面部口鼻之間,且為督脈、手足陽明經(jīng)之會(huì)穴,所以該穴可醒神解閉、鎮(zhèn)靜安神、通調(diào)督脈、升陽通氣?，F(xiàn)代研究亦證實(shí)水溝穴對(duì)急性腦缺血具有良好的急救效應(yīng),可增加腦血流量,減輕腦缺血導(dǎo)致的神經(jīng)損傷,有效地保護(hù)缺血神經(jīng)元結(jié)構(gòu),促進(jìn)機(jī)能恢復(fù),縮短病程,降低致死致殘率等[25-29]。

腦缺血急性超早期為發(fā)病的6 h內(nèi)。腦動(dòng)脈發(fā)生阻塞后,超早期的缺血缺氧導(dǎo)致的能量代謝障礙引起興奮性氨基酸的釋放將迅速不可逆地加劇腦損傷程度,與此同時(shí),抑制性氨基酸作為一種內(nèi)源性腦保護(hù)物質(zhì)也將迅速反應(yīng)性增加。本研究中模型組腦組織損傷局部細(xì)胞外液的Glu含量較空白組急劇堆積,且GABA含量也急劇增加。結(jié)果表明腦缺血急性超早期引起Glu興奮性神經(jīng)毒性作用導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷,但與此同時(shí)腦內(nèi)也反應(yīng)性啟動(dòng)GABA的保護(hù)抑制。對(duì)于腦缺血急性超早期,最重要的是采取腦保護(hù)措施以降低神經(jīng)細(xì)胞死亡。本研究采取針刺水溝穴對(duì)腦缺血急性超早期進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示針刺組腦組織損傷局部細(xì)胞外液中Glu含量較模型組急劇減少,而在急性腦缺血超早期針刺組腦組織損傷局部細(xì)胞外液中GABA含量較模型組無明顯差異。所以本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,超早期針刺水溝穴可顯著改善急性腦缺血大鼠紋狀體細(xì)胞外液氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)失衡,在維持GABA的抑制性保護(hù)作用的同時(shí)可有效地減少Glu的釋放。

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Effect of Ultra-early Acupuncture at Point Shuigou(GV26) on Amino Acid Neurotransmitters in the Striata of Rats with Acute Cerebral Ischemia

1,2,2,3.

1.311500,; 2.310005,; 3.324400,

To investigate the regulating effect of ultra-early acupuncture at point Shuigou (GV26) on metabolic disorders of amino acid neurotransmitters in striatal extracellular fluid in rats with acute cerebral ischemia.A microdialysis cannula was implanted in all the experimemtal rats. A rat model of permanent middle cerebral artery occlusion (PMCAO) was made by thread occlusion. The rats were randomized to blank, acupuncture and model groups. The acupuncture group received acupuncture at point Shuigou with the needle retained for 2 hrs. The blank and model groups were not treated. Striatal extracellular fluid was sampled by microdialysis in four periods of time. The glutamic acid (Glu) andg-aminobutyric acid (GABA) contents of microdialysis samples were measured using High Performance Liquid Chromatography with Fraunhofer Line Discriminator (HPLC-FLD) for dynamic observation.The Glu content of dialysate tended to increase in four periods of time in the model group (＜0.05). There was no statistically significant difference in the Glu content of dialysate between four periods of time in the acupuncture and blank groups (＞0.05). The Glu content of dialysate in four periods of time was higher in the model and acupuncture groups than in the blank group (＜0.05) and lower in the acupuncture group than in the model group (＜0.05). There was no statistically significant difference in the GABA content of dialysate between four periods of time in the blank, model acupuncture and groups (＞0.05). The GABA content of dialysate in four periods of time was higher in the model and acupuncture groups than in the blank group (＜0.05). There was no statistically significant difference in the GABA content of dialysate between the acupuncture and model groups in four periods of time (＞0.05).Ultra-early acupuncture at point Shuigou can effectively regulate metabolic disorders of amino acid neurotransmitters in striatal extracellular fluid in rats with acute cerebral ischemia, reduce ischemia and anoxia-induced excessive Glu release and maintain an endogenetic inhibiting effect on GABA.

Acupuncture; Point, Shuigou (GV26); Ultra-early cerebral ischemia; Glutamic acid;g-aminobutyric acid; Rats

1005-0957(2018)08-0951-06

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.08.0951

2018-02-20

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81303040)

于曉蕾(1989—),女,蒙古族,碩士,Email:yxl1108@126.com

劉婧(1982—),女,主治醫(yī)師,博士,Email:liujing0113@126.com