半邊蓮生物堿類物質(zhì)鑒定及對(duì)Hela細(xì)胞抑制作用研究

孫 堯，張 皓，孫佳明，張 輝*，高曉晨*

（1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)，長(zhǎng)春 130012；2.吉林省經(jīng)濟(jì)管理干部學(xué)院，長(zhǎng)春 130012；3.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

半邊蓮是桔?？疲–ampanulaceae）半邊蓮屬（Lobelia L.）植物半邊蓮（Lobelia chinensis）的帶根全草，在我國(guó)安徽、福建、廣東、廣西、貴州、海南均有生長(zhǎng)。我國(guó)《中華本草》記載半邊蓮有祛痰、止咳、增強(qiáng)免疫力等功效[1-4]。目前，我國(guó)的半邊蓮屬植物的研究較少，主要停留在中草藥配伍方面的研究。生物堿是藥物常見的化學(xué)成分，同時(shí)作為被視為現(xiàn)代藥物的最主要來(lái)源之一，生物堿是一類常見于植物中的主要含氮有機(jī)化合物[5-8]。大部分生物堿類化合物成分具有抗腫瘤、抗感染抗菌等藥理活性[9-10]。本研究主要針對(duì)半邊蓮的生物堿類化學(xué)成分，對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗腫瘤活性進(jìn)行研究，以期為半邊蓮的化學(xué)成分鑒定及其在抗腫瘤研究中的開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑 半邊蓮藥材采由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)提供。1640培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司產(chǎn)品），胎牛血清（康源生物公司產(chǎn)品），細(xì)胞培養(yǎng)板（英國(guó)NEB公司產(chǎn)品），牛血清白蛋白及MTT均由實(shí)驗(yàn)室保存。所用試劑均為分析純。

1.2 分離和測(cè)試用儀器 Acquity UPLC-Synapt G2 MS色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters公司產(chǎn)品），LTQ型離子阱質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品），高速逆流色譜儀（TBE 20上海同田生化技術(shù)有限公司產(chǎn)品），Eppendorf centrifuge 5810R 臺(tái)式高速大容量離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品），GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備產(chǎn)品），DZF-6050型真空干燥箱（上海一恒科技有限公司產(chǎn)品），KQ5200型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品），BS110S電子天平（德國(guó)賽多利斯股份公司產(chǎn)品），T-500型電子天平（美國(guó)雙杰兄弟有限公司產(chǎn)品），酶標(biāo)儀（ELX80 美國(guó)BIOTEK公司產(chǎn)品）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 半邊蓮生物堿類化學(xué)成分的提取 取干燥的半邊蓮全草0.5 kg進(jìn)行粉碎，用5 L乙醇（95%）乙醇溶液超聲溶解，將乙醇溶液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提取2次，每次旋蒸提取時(shí)間為3 h，提取溶液回收后進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥96 h。冷凍干燥成粉末后，取1 mg半邊蓮凍干粉經(jīng)過(guò)超聲溶解法溶于10 mL正丁醇中，溶解后將10 mL正丁醇經(jīng)氮吹儀吹干，將吹干后的溶質(zhì)，溶于10 mL甲醇中制成制備液，用于后續(xù)檢測(cè)。

2.2 半邊蓮生物堿類化學(xué)成分質(zhì)譜分析 Finnigan LTQ質(zhì)譜儀：毛細(xì)管溫度250℃；噴霧電壓 4.0 kV，透鏡電壓 -250 V；毛細(xì)管電壓 -4 V；質(zhì)量檢測(cè)范圍 m/z：200～1 500；注射泵流速 5 μL/min；鞘氣為氮?dú)饬魉?0 mL/min。

色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；進(jìn)樣體積為10 μL；流動(dòng)相流速為0. mL/min；柱溫為20℃，流動(dòng)相A：0.1%甲酸水；流動(dòng)相B：乙腈；流動(dòng)相C：甲醇。

2.3 單體生物堿的提取 根據(jù)分離生物堿的性質(zhì)及生物堿甲醇溶液極性的大小，采用分析型HSCCC確定選用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（6:3:2:5，V/V）體系。經(jīng)過(guò)超聲脫氣30 min后，在紫外波長(zhǎng)254 nm下進(jìn)行檢測(cè)。

采用制備型HSCCC進(jìn)行分離制備。固定的流速20 mL/min，泵入HSCCC管柱中，管柱中流出50 mL后停泵，運(yùn)行主機(jī)，調(diào)整流動(dòng)相，使之達(dá)到兩相溶劑動(dòng)態(tài)平衡，50 mL待分離樣品注入HSCCC 儀中，分離生物堿單體組分。紫外檢測(cè)波長(zhǎng)柱溫25 ℃。根據(jù)色譜圖收集各組分。

2.4 Hela細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞從- 80 ℃冰箱中迅速取出，置于37 ℃水浴鍋中，待細(xì)胞解凍后，漿細(xì)胞懸浮液加入15 mL離心管中，再向離心管中加入4 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，1 000 r/min離心3 min后，棄上清，加入1 mL培養(yǎng)液吹勻，置于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿體系為9 mL培養(yǎng)液和1 mL血清。

待細(xì)胞在培養(yǎng)皿中鋪滿80%以上面積時(shí)，將皿中培養(yǎng)基全部棄掉，加入2 mL胰酶，37℃消化2～5 min，待皿中細(xì)胞不再貼壁時(shí)，加入1 mL血清和3 mL培養(yǎng)基吹起，加入15 mL離心管中離心，將沉淀用3 mL培養(yǎng)液吹起，平均分成3份，分入3個(gè)皿中，繼續(xù)培養(yǎng)。

2.5 Hela細(xì)胞MTT實(shí)驗(yàn) 10%胎小牛血清加入到96孔板中，每孔加入1 000～10 000個(gè)胎牛血清得細(xì)胞懸浮液，每孔加入200 μL。待細(xì)胞完全貼壁后，每孔加入終濃度為1 mg/mL的各種中藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)24 h后，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制，pH = 7.4）20 μL繼續(xù)孵育4 h，吸取上清液并棄掉，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分融解。酶標(biāo)儀以490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)，各孔光吸值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。抑制率/% =（對(duì)照組OD值－測(cè)試組OD值）/對(duì)照組OD值×100

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 半邊蓮主要生物堿類化學(xué)成分分析 如圖1所示，在正離子模式下共鑒定出5個(gè)主要的化合物離子峰。對(duì)以上峰1～5峰進(jìn)行二級(jí)譜碎裂MS/MS分析顯示，根據(jù)保留時(shí)間及二級(jí)普特征碎片及相關(guān)文章參考，鑒定出化合物2，3，4，5為8，10-二乙基山梗酮，新山梗菜堿B，新山梗菜堿A及山梗新堿如表1所示，其主要碎裂方式為失去1分子2-丁酮（72 Da），失去1分子丙酮（58 Da），或失去1分子甲基（14 Da），化合物1為未知化合物，根據(jù)二級(jí)普碎裂方式推測(cè)可能結(jié)構(gòu)式如圖2所示。

3.2 新山梗菜堿B和新山梗菜堿A逆流色譜提取 本研究采用HSCCC提取含量較高的新山梗菜堿B和新山梗菜堿A2種生物堿，分別得到5 mL新山梗菜堿B和5 mL新山梗菜堿A溶液，以硫酸山梗堿為標(biāo)品，采用紫外分光光度計(jì)，繪制硫酸山梗堿含量標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)制硫酸山梗堿標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算新山梗菜堿B和新山梗菜堿A含量，新山梗堿B含量為3.2 mg/mL，新山梗菜堿A含量為2.4 mg/mL。5 mL新山梗菜堿B和新山梗菜堿A經(jīng)氮吹后。加水配置1 mg/mL的溶液以備Hela細(xì)胞MTT檢測(cè)用。

圖1 梗菜中主要生物堿類化合物總離子流圖

圖 2 定出山梗菜的主要生物堿化學(xué)結(jié)構(gòu)式及碎裂方式，紅色虛線表示MS/MS特征碎片化學(xué)鍵斷裂方式

3.3 半邊蓮提取物及其單體生物堿對(duì)Hela細(xì)胞MTT檢測(cè) 為了確定半邊蓮提取物及其單體生物堿樣品是否對(duì)Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，筆者對(duì)梗菜提取物及其單體生物堿樣品對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測(cè)。如表2所示，MTT實(shí)驗(yàn)中加入半邊蓮提取物及其單體生物堿樣品后，對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用。其中培養(yǎng)24 h后，抑制率達(dá)到最高。同時(shí)可以看出半邊蓮醇提取物對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果不如相同濃度下半邊蓮單體生物堿對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，所以可以確定山梗菜中的生物堿對(duì)Hela細(xì)胞癌癥模型起抑制作用，且半邊蓮中起決定抗腫瘤效果的是半邊蓮中的生物堿成分，其中新山梗菜堿A對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率略高于新山梗菜堿B。

表1 山梗菜中主要生物堿鑒定

表2 1 mg/mL樣品對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率

4 結(jié)論

本研究采用乙醇回流提取法及正丁醇萃取法，提取出半邊蓮中的主要活性成分，通過(guò)UPLC-MS及ESI-MS2的方法，共鑒定出5種半邊蓮中主要生物堿成分，通過(guò)二級(jí)譜碎裂及保留時(shí)間及相關(guān)文獻(xiàn)的查閱確定5種生物堿為8，10-二乙基山梗酮，新山梗菜堿B，新山梗菜堿A，山梗新堿及一種未知生物堿并推測(cè)及結(jié)構(gòu)式，通過(guò)HSCCC提取主要的2種生物堿新山梗菜堿B和新山梗菜堿A。并通過(guò)MTT法檢測(cè)半邊蓮總提取物、新山梗菜堿B和新山梗菜堿A2種生物堿分別在24、 48、72 h對(duì)Hela細(xì)胞的活性檢測(cè)。可以看出半邊蓮醇提物及其單體生物堿均對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)具有抑制作用，相同給藥濃度下半邊蓮醇提取物對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果不如半邊蓮單體生物堿對(duì)Hela細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，可以確定半邊蓮中的生物堿對(duì)Hela細(xì)胞癌癥模型起抑制作用。