姜黃素對CCl4所致急性肝損傷大鼠的保護作用及其機制研究*

隋菱，杜紀坤，鄭靜彬，蔡國弟，李莉

姜黃素（curcumin）是姜科草本植物姜黃（curcuma longa）根莖的主要活性成分，是一種具有β-二酮結(jié)構(gòu)的多酚類化合物，廣泛應(yīng)用于制作調(diào)味劑、食品色素和中草藥。近年來，姜黃素成為天然藥物中的研究熱點，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤[1-4]等廣泛的藥理作用。肝臟是人體的重要器官，是物質(zhì)合成與代謝、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換的重要樞紐，因此肝臟極易受到各種外源性物質(zhì)的損傷，從而引起急性或慢性肝臟疾病[5，6]。已有研究表明，姜黃素對肝損傷具有很好的治療作用[7，8]。本研究在四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）誘導的急性肝損傷大鼠，觀察了姜黃素的干預效果，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑與藥物 健康雄性SPF級SD大鼠60只，購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心，CCl4和姜黃素（Sigma公司）；檢測乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司）；檢測白介素 -6（interleukin-6，IL-6）和瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的ELISA試劑盒（Bio-Rad公司）；檢測環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2） 的 ELISA 試劑盒（Cell Signaling Technology公司）；檢測前列腺素 E2（prostaglandin 2，PGE2）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 急性肝損傷模型的制備 隨機將大鼠分為對照組、模型組、小劑量姜黃素組、中劑量姜黃素組、大劑量姜黃素組和水飛薊素組，每組10只。姜黃素給藥組分別按 25 mg·kg-1、50 mg·kg-1、100 mg·kg-1姜黃素灌胃，水飛薊素組按100 mg·kg-1灌胃，在對照組、模型組則給予等體積生理鹽水灌胃，共30 d。在末次給藥1 h后，給予模型組和姜黃素組CCl4（20 mg·kg-1）玉米油溶液（2 ml·kg-1）腹腔注射，給予對照組腹腔注射等體積玉米油溶液，禁食不禁水。24 h后，給予動物烏拉坦麻醉，經(jīng)下腔靜脈取血，離心后取得血清，置于-20℃保存。采血后迅速摘除肝臟，用冷PBS緩沖液洗滌干凈，濾紙吸干水分后，置于-80℃保存。

1.3 肝組織病理學檢查 取肝組織，置于10%福爾馬林固定，常規(guī)脫水浸蠟，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，脫蠟透明后行HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝組織病理學變化。

1.4 血清LDH和PGE2水平檢測 按照試劑盒操作說明書操作測定。

1.5 肝組織勻漿 IL-6、TNF-α 和 COX-2水平檢測 取肝組織，加入9倍量生理鹽水后用超聲粉碎機粉碎，制成組織勻漿，取上清。使用Luminex 100 analyzer（Luminex Corp.Austin，TX），按照 Bio-Rad公司試劑盒說明書檢測IL-6和TNF-α水平。采用MasterPlex QT Analysis version 2（MiraiBio，Alameda，CA）制作標準曲線，進行定量分析。按照試劑盒說明書操作測定COX-2水平。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素對CCl4所致急性肝損傷大鼠肝組織病理學變化的影響 對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰，肝細胞呈索狀排列，無壞死及脂肪變性（圖1A）；與對照組比，CCl4模型組可見以中央靜脈區(qū)為中心的大片狀肝細胞壞死、腫脹、空泡形成和炎性細胞浸潤，大部分正常肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞或消失，肝細胞索狀排列紊亂，肝組織損傷明顯（圖1B）；水飛薊素組肝細胞濁腫減輕，炎性細胞浸潤減少（圖1C）；經(jīng)大、中、小劑量姜黃素處理后，肝小葉中心大片狀肝細胞壞死、腫脹、空泡形成和炎性細胞浸潤均有不同程度的減少，肝組織損傷均有不同程度的改善（圖1D～F），其中大劑量姜黃素組和水飛薊素組效果最好，組織學改變趨于正常。

圖1 各組大鼠肝組織病理學變化（HE，100×）

2.2 各組大鼠血清LDH和PGE2水平變化 模型組大鼠血清LDH 水平為（6458.00±423.72）IU/L，顯著高于對照組[（1375.00±67.45） IU/L，P<0.001]，而提前給予大劑量姜黃素處理組和水飛薊素處理組的大鼠血清LDH 水平均顯著降低（P<0.05），提示姜黃素對CCl4所致的急性肝損傷具有保護作用；模型組大鼠血清 PGE2 含量為（130.02±4.30）pg/ml，明顯高于對照組[（51.27±0.86）pg/ml，P<0.001]，而在各劑量姜黃素和水飛薊素干預組大鼠血清PGE2水平均顯著低于模型組（P<0.05）。

2.3 各組大鼠肝組織勻漿細胞因子水平比較 模型組肝組織IL-6和TNF-α含量顯著高于對照組（P<0.01），表明CCl4能夠有效刺激肝細胞分泌炎性細胞因子IL-6和TNF-α。各劑量姜黃素處理組和水飛薊素組可以顯著降低大鼠肝組織勻漿細胞因子水平（P<0.01，表1），提示姜黃素對CCl4誘導的炎性細胞因子分泌具有抑制作用，其作用呈劑量依賴性增強。

表1 各組大鼠肝組織勻漿細胞因子水平（±s）比較

表1 各組大鼠肝組織勻漿細胞因子水平（±s）比較

與對照組比，①P<0.01；與模型組比，②P<0.01

IL-6（μM） TNF-α（μM）對照組 10 52.8±3.0② 67.4±5.2②模型組 10 102.5±6.3① 120.3±3.5①小劑量姜黃素 10 83.7±3.3② 109.3±5.8②中劑量姜黃素 10 71.3±2.4② 87.2±3.7②大劑量姜黃素 10 61.0±3.0② 71.3±6.2②水飛薊素 10 59.8±3.6② 70.4±2.2②只

2.4 各組大鼠肝組織勻漿COX-2水平比較 COX-2是一種誘導酶。當肝臟出現(xiàn)炎癥后，肝組織COX-2水平增加[9]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝組織COX-2含量為（423.74±12.42）pg/mg/ml，顯著高于對照組的［（232.45±13.95）pg/mg/ml，P<0.01]，而大、中、小劑量姜黃素組和水飛薊素組大鼠肝組織COX-2含量均較模型組顯著降低（P<0.01，圖2）。

圖2 各組大鼠肝組織勻漿COX-2水平比較

3 討論

CC14是經(jīng)典的誘導實驗性肝損傷動物模型的外源性化合物，被廣泛用于護肝藥物的篩選和研發(fā)[10-12]。CCl4致肝損害的主要機制為肝內(nèi)活化后產(chǎn)生強毒性的二氯甲基自由基（·CCl2）和過氧化甲基自由基（·OOCC12），引發(fā)脂質(zhì)過氧化，導致肝細胞膜的通透性增加，肝細胞內(nèi)大量儲存的LDH被釋放進入血循環(huán)。本實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CCl4處理后的大鼠血清LDH水平與對照組相比顯著升高。在各劑量姜黃素和水飛薊素預處理之后，各組大鼠血清LDH明顯低于CCl4模型組，表明姜黃素具有一定的膜穩(wěn)定作用，減輕了肝損傷程度，對CCl4誘導損傷的肝細胞起到了較好的保護作用。

各種因素造成肝損傷時，肝組織Kuffer細胞被激活，產(chǎn)生并釋放大量的細胞因子，如IL-6和TNF-α等，參與肝臟的炎性損傷[13-15]。本實驗結(jié)果顯示，與對照組比，模型組大鼠肝組織IL-6和TNF-α含量明顯增高，而不同劑量姜黃素給藥組和水飛薊素組可以顯著降低CCl4致肝損傷大鼠肝組織IL-6和TNF-α水平，表明姜黃素可抑制肝臟損傷后IL-6和TNF-α的異?；罨?，減少炎癥的發(fā)生，通過抑制肝臟炎癥因子的產(chǎn)生，保護肝臟。

COX-2是一種誘導型酶。在正常狀態(tài)下在大多數(shù)組織中很少表達COX-2，但當細胞受到致病因素等刺激時，Kuffer細胞被激活，產(chǎn)生大量細胞因子，可誘導COX-2合成和釋放，參與肝臟炎性損傷。大量報道證實，COX-2抑制劑可以緩解CCl4所致的肝損傷[9，16-19]，這也為肝損傷的治療提供了新的思路?；ㄉ南┧嵬ㄟ^COX-2生成代謝產(chǎn)物前列腺素（prostaglanding，PGs），是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)，該途徑被認為是急慢性炎癥的重要通路。炎癥的發(fā)生發(fā)展與PGs含量關(guān)系密切，而在炎癥過程中，PGE2作用最強。研究表明，COX-2及其產(chǎn)物PGs通過介導蛋白質(zhì)、糖類及脂肪代謝，干擾肝臟正常的代謝功能，參與肝臟的炎性損傷[21-25]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織COX-2含量增多，且血清PGE2含量異常增高，推測其通過激活環(huán)氧合酶途徑介導肝細胞損傷。與模型組相比，姜黃素給藥組COX-2含量顯著降低，并且PGE2水平顯著降低，可能是由于姜黃素抑制了由CCl4引起的一系列免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的炎性因子，從而使COX-2含量減少，逆轉(zhuǎn)炎癥因子對肝細胞所造成的損傷，從而改善肝功能。

綜上所述，姜黃素對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷有保護作用，可能是通過抑制大鼠肝組織CCl4的代謝，抑制炎癥反應(yīng)的激活，減少細胞因子的釋放而實現(xiàn)的。但是，姜黃素對肝臟作用的具體機理和對人體的作用如何，還有待于進一步的研究。