蛋白芯片技術檢測幽門螺桿菌抗體200例結(jié)果分析

賈玉婷,徐曉雯,余 瑤,王 丹

(吉林大學第一醫(yī)院 胃腸內(nèi)科，吉林 長春 130021)

幽門螺桿菌(H.pylori)感染已被公認是引起慢性胃炎、消化性潰瘍的主要病因[1,2]。但并非所有患者感染后都會致病，是否致病除了與宿主本身的個體差異及環(huán)境等因素有關外，所感染菌株自身的基因型也是一個不可忽略的因素。H.pylori本身含有細胞毒相關基因A(CagA)、空泡毒素基因A(VacA)及尿素酶 (Ure) 等多種抗原蛋白，這些抗原可以刺激機體免疫系統(tǒng)，從而產(chǎn)生針對不同抗原決定簇的相應的多種抗體。研究表明不同的抗體與H.pylori感染所致的疾病嚴重程度及預后有密切的關系[3]，本研究通過測定血清中CagA、VacA及Ure三種抗體水平，探討不同毒力基因型H.pylori菌株的感染與胃十二指腸疾病嚴重程度之間的相關性。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2012年1月至2016年1月就診于吉林大學第一醫(yī)院胃腸內(nèi)科門診或住院的200例H.pylori感染患者，均經(jīng)過尿素14C呼氣試驗檢測陽性，且同期胃鏡證實為慢性胃炎或消化性潰瘍的患者。排除檢查前4周內(nèi)服用過抗菌藥物、鉍劑、質(zhì)子泵抑制劑或可能干擾檢測結(jié)果的中藥制劑等，或既往有消化道手術史者。

1.2 研究方法

蛋白芯片系統(tǒng)檢測血清H.pylori抗體：嚴格按照西安聯(lián)爾生物科技有限公司提供的H.pylori抗體蛋白芯片檢測試劑盒說明書操作，用配套的生物芯片閱讀系統(tǒng)對結(jié)果進行分析。受試者清晨空腹采集靜脈血2 ml，4 h內(nèi)以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，分離血清后立即進行蛋白芯片檢測。檢測步驟如下所述：(1)在芯片的上片盒窗口內(nèi)滴加4滴試劑A，使膜表面完全浸濕；(2)待完全滲入后，室溫放置1 min，加待檢血清100 μl；(3)待血清完全滲入后，再滴加6滴試劑B；(4)待試劑B完全滲入后，滴加10滴試劑C；(5)待試劑C完全滲入后，最后滴加6滴試劑D；(6)在反應完畢后30min之內(nèi)，將芯片放入芯片閱讀系統(tǒng)進行分析。通過Biochip system 2.0軟件分析患者血清中CagA、VacA、Ure三種抗體感染率。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料用百分率表示，不同率的比較采用χ2檢驗；計量資料以mean±SD表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

采集200例患者，其中男97例，女103例，年齡18-75歲，平均年齡(43.86±13.80)歲。其中十二指腸球部潰瘍(duodenal ulcer，DU)41例、胃潰瘍(gastric ulcer，GU)8例，復合型潰瘍(compound ulcer，CU)12例，慢性胃炎-萎縮性(chronic atrophic gastritis，CAG)20例、慢性胃炎-非萎縮性(chronic non-atrophic gastritis，CNAG)119例。

2.2 不同毒力因子的分布情況

2.2.1CagA抗體分布情況 CagA抗體總陽性率為19%，DU、GU，CU，CAG、CNAG的CagA抗體陽性率分別為31.7%、25%、25%、25%、12.6%，DU、GU、CU、CAG的CagA抗體檢出率明顯高于CNAG(P<0.001)，而DU的檢出率更明顯；結(jié)果見表1。

2.2.2VacA抗體分布情況 VacA抗體總陽性率為39.5%，5組VacA抗體陽性率分別為56.1%、37.5%、50%、40%、32.8%，各組之間的差異無統(tǒng)計學意義(P=0.110)，結(jié)果見表1。

2.2.3Ure抗體分布情況 Ure抗體總陽性率為75.5%，五組的Ure抗體陽性率分別為80.5%、75%、75%、75%、73.9%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.654)。結(jié)果見表1。

表1 H.pylori陽性的胃十二指腸疾病中毒力因子的分布情況

3 討論

H.pylori在我國感染率仍高達約50%[4]，而目前檢測的方法主要有侵入性和非侵入性兩種，各有優(yōu)缺點。侵入性方法主要包括快速尿素酶試驗、胃黏膜組織切片染色鏡檢、細菌培養(yǎng)以及放大染色內(nèi)鏡的應用，這類方法均通過胃鏡檢查和(或)胃黏膜活檢取樣，雖然具有較高的準確性，但部分患者因恐懼心理無法耐受，或檢查過程中可能出現(xiàn)H.pylori或其它病原菌交叉感染，或缺乏放大或電子染色內(nèi)鏡的相應設備等原因，使得臨床常規(guī)應用受到了限制。非侵入性的檢測方法包括13C或14C尿素呼氣試驗、糞便抗原試驗和血清學試驗等。其中蛋白芯片技術是一種集快速、簡便、無創(chuàng)、準確、費用低等優(yōu)點于一體的血清學檢測方法，只需采集患者的血清即可，無放射性損傷，而且可以避免交叉感染。以往認為血清學檢查只能用于流行病學調(diào)查，而不適于臨床診斷，但通過大量的研究表明，H.pylori血清學篩查，能夠發(fā)現(xiàn)所感染H.pylori不同毒力基因型，結(jié)合不同基因型與疾病嚴重程度的相關性，不但可以預測疾病風險指導患者進一步檢查及得到相應的根除治療，同時也對反復根除失敗的患者提供繼續(xù)治療的風險效益評估。本研究通過蛋白芯片方法快速檢測出H.pylori多種抗體，發(fā)現(xiàn)感染不同毒力基因型與胃炎或消化性潰瘍有一定的相關性，可以作為臨床風險效益評估的輔助手段。

H.pylori通過“口-口”或“糞-口”等傳播途徑進入患者胃內(nèi)，一部分被胃酸殺滅，另一部分依靠其鞭毛穿過胃黏液層，定值于胃黏膜上皮細胞表面，不但可以避免胃酸對其的殺滅作用，與此同時機體的免疫機能也很難將其根除。由于其自身含有CagA、VacA、Ure等多種抗原蛋白，不同毒力基因型的H.pylori通過各自不同的機制促使胃、十二指腸黏膜發(fā)生炎癥反應，進而導致了感染后出現(xiàn)不同的臨床反應，即基因型的多態(tài)性導致了致病的差異性，大量的研究結(jié)果[5-10]表明，CagA陽性的H.pylori為高毒力株，與萎縮性胃炎、消化性潰瘍的發(fā)生及與疾病的發(fā)展和愈后有著密切的關系，即Cag A陽性的H.pylori感染者有更明顯的消化道粘膜損傷。陳周利[11]等的研究表明，CagA毒力蛋白抑制了人體內(nèi)IL-9的表達，而IL-9可能對H.pylori感染所致的黏膜損害發(fā)揮抑制作用保護胃黏膜，感染后患者血清中IL-9減少，胃黏膜失去了其保護作用，故感染CagA陽性的H.pylori易發(fā)生黏膜的損傷。另有研究表明[12]Cag A抗原誘導消化道黏膜中細胞因子IL-8 的高表達，而IL-8可趨化中性粒細胞在消化道黏膜中浸潤，通過促進中性粒細胞的聚集和活化啟動炎癥過程，從而導致了消化道黏膜上皮的損害，出現(xiàn)相應的消化道不適癥狀。本研究中應用蛋白芯片技術對明確診斷H.pylori感染患者的血清中多種抗體進行檢測，其中200例患者中CagA抗體總陽性率為19%，相對偏低，與文獻報道不同[6,7]，分析原因可能與本地區(qū)感染的菌株基因型不同有關，相關研究結(jié)果也表明[13]，H.pylori感染存在地域性差異，不同地區(qū)存在不同基因型的優(yōu)勢菌種，其所含CagA也不盡相同，直接影響檢測結(jié)果。CagA抗體總陽性率雖然偏低，但在DU、GU、CU、CAG中 CagA抗體陽性率卻顯著高于CNAG(P<0.001)，表明CagA與疾病的嚴重程度及預后有著密切的關系，在判斷疾病的嚴重程度上仍有一定價值，Cag A抗體陽性的H.pylori感染者有更明顯的消化道粘膜損傷，必須予以積極的根除治療。提示臨床上通過CagA的檢測對反復根除失敗的患者是否繼續(xù)根除治療有一定的指導意義。VacA是一種95 kD的蛋白質(zhì)毒素，其作用主要是引發(fā)促分裂原活化蛋白激酶激活，細胞膜通透性增高，細胞內(nèi)形成空泡，誘導細胞凋亡和免疫功能紊亂導致免疫損傷，并因此協(xié)助細菌逃避機體的免疫監(jiān)視[14,15]。因為VacA基因的多態(tài)性，使其在有毒力的H.pylori菌株中作用效能存在著較大的差異。而幾乎所有的H.pylori均含有尿素酶，其可分解尿素產(chǎn)氨，導致細菌微環(huán)境pH值增高，使細菌能夠穿過胃黏液層到達黏膜表面定值和損傷胃黏膜。本研究中VacA、Ure抗體總陽性率為分別為39.5%和75.5%，5組VacA、Ure抗體陽性率之間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.110，P=0.654)，VacA、Ure在5種胃十二指腸疾病之間未顯示明確相關性，提示VacA、Ure陽性的H.pylori感染者，利用其判斷慢性胃炎或消化性潰瘍的嚴重程度及愈后方面作用有限。隨著臨床H.pylori治療的廣泛開展，需要指導后續(xù)治療的反復根除治療失敗者、根除治療風險增加的老年感染者均需要進行個體獲益-風險綜合評估，實現(xiàn)個體化處理，而血清學抗體檢測的發(fā)展和完善，無疑會成為未來重要的輔助評估手段。

綜上所述，蛋白芯片技術檢測多種抗體并進行毒力分型，對H.pylori感染的診斷、評估預后及指導治療有著重要的臨床意義；不同抗體的存在與各種胃十二指腸疾病的發(fā)生關系密切，其中毒力因子CagA抗體陽性的菌株感染與消化性潰瘍、慢性萎縮性胃炎的發(fā)生密切相關。未來開展H.pylori不同基因分型菌株在早期胃癌中的表達研究將成為新的探索方向。