焦磷酸測(cè)序鑒定建澤瀉方法的建立

盧雪花 孫鳳靈 李麗莎

【摘 要】 目的：建立一種基于內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS 2）序列突變位點(diǎn)鑒別建澤瀉的焦磷酸測(cè)序方法。方法：分別提取建澤瀉與川澤瀉的須根、葉片、葉柄DNA，采用焦磷酸測(cè)序方法進(jìn)行分析鑒定，并通過毛細(xì)管電泳測(cè)序驗(yàn)證方法的正確性。結(jié)果：建立了一種基于ITS 2序列焦磷酸測(cè)序鑒定方法，經(jīng)毛細(xì)管電泳測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果準(zhǔn)確可靠。建澤瀉ITS 2序列中的突變位點(diǎn)A-T的突變頻率均不小于83%。結(jié)論：焦磷酸測(cè)序方法可以準(zhǔn)確鑒定不同基源的澤瀉物種。

【關(guān)鍵詞】 焦磷酸測(cè)序；建澤瀉；鑒定；ITS 2

【中圖分類號(hào)】R286.0 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）16-0026-03

Abstract：Objective Establish a pyrosequencing method based on the ITS 2 sequence mutation sites to identify Alisma orientalis. Methods DNA was extracted respectively from roots， leaves and petiole of Alisma orientalis and analyzed by pyrosequencing. The correctness of the method was verified by capillary electrophoresis sequencing. Results A pyrosequencing method based on the ITS 2 sequence was established. This method was verified by capillary electrophoresis sequencing to be accurate and reliable. The mutation frequency from A to T site was not less than 83% in the ITS 2 sequence of Alisma Orientalis. Conclusion Pyrosequencing can accurately identify Alisma species from different sources.

Keywords：Pyrosequencing； Alisma Orientalis； Identification； ITS2

澤瀉為多年沼生澤瀉科植物澤瀉Alisma orientalis （Sam.）Juzep.的干燥塊莖，最早歷史記載可追溯到《神農(nóng)本草經(jīng)》。其性寒味甘，有泄熱、利水滲濕、化濁降脂的功效[1]，主要有利尿[2]、降血糖[3-5]，降血脂[6-9]等活性。澤瀉主產(chǎn)福建、四川、江西等地，素有“建澤瀉”、“川澤瀉”、“江澤瀉”之稱，以建澤瀉、川澤瀉量大且使用廣泛，其中又以建澤瀉質(zhì)佳，被載入中國的道地藥材。目前主要采用性狀鑒別和化學(xué)成分分析對(duì)澤瀉進(jìn)行鑒定，該方法鑒定結(jié)果主觀性較強(qiáng)，準(zhǔn)確性無法得到保證。焦磷酸測(cè)序技術(shù)（Pyrosequencing） 是一種基于酶催化反應(yīng)的新一代測(cè)序技術(shù)，其精確性和可重復(fù)性高，并能夠?qū)崟r(shí)、直觀地提供序列信息，同時(shí)能定性定量分析差異堿基。該技術(shù)利用生物素標(biāo)記一條擴(kuò)增引物，擴(kuò)增產(chǎn)物無需熒光標(biāo)記與電泳分離，因此操作更為簡便、快捷。本實(shí)驗(yàn)采收福建省建甌建澤瀉藥材，同時(shí)以川澤瀉作為對(duì)照藥材（采自四川省眉山），采用焦磷酸測(cè)序方法鑒定其基源，為今后澤瀉的質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 PCR儀（美國Bio-Rad）；高速離心機(jī)（德國eppendorf）；生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司）；超微量核酸/蛋白分析儀（英國Biochrom）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（江南儀器廠）；電泳儀（六一儀器廠）；暗箱式紫外投射儀（上海顧村電光儀器廠）；實(shí)時(shí)定量焦磷酸測(cè)序儀（凱杰生物工程有限公司）；恒溫孵育器（德國eppendorf）。

1.2 材料 建澤瀉藥材采自福建省建甌吉陽鎮(zhèn)，川澤瀉藥材采自四川省眉山市彭山區(qū)謝家鎮(zhèn)，經(jīng)福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院徐榕青研究員鑒定為澤瀉科植物澤瀉。分別取建澤瀉與川澤瀉的須根、葉柄及葉片樣本。

1.3 試劑 Binding Buffer、Denaturation Solution、Wash Buffer、annealing buffer、PyroMark Gold Q 24 Reagents均購自凱杰生物工程有限公司；2×EasyTaqPCRSuperMix（AS111-14）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）購自美國BIOSHAPR；三羥甲基氨基甲烷、瓊脂糖購自美國NOVON；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)引物由鉑尚生物技術(shù)公司合成。

2 方法

2.1 DNA提取 采用的改良CTAB法分別提取建澤瀉、川澤瀉的須根、葉柄及葉片DNA。

2.2 PCR擴(kuò)增 25μL PCR擴(kuò)增體系中包含有1μL DNA模板（約50～100ng），12.5μL 2×Taq PCR MasterMix，10μmol/L上下游引物各1μL（引物序列見表1），用ddH2O補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增條件為94℃-5min；（94℃-30s，58℃-30s，72℃-45s）×30 cycle；72℃-5min；擴(kuò)增產(chǎn)物保存于4℃。

2.3 焦磷酸測(cè)序 取5μL PCR產(chǎn)物、1μL的beads、40μL bingding buffer，補(bǔ)足MQ至80μL，25℃1400rpm振蕩孵育10min。經(jīng)變性和洗滌后，使未標(biāo)記生物素的DNA單鏈與已標(biāo)記單鏈分離，將含有beading的反應(yīng)板于80℃孵育2min后冷卻至室溫。試劑倉中加入所需的酶、底物和dNTP等進(jìn)行檢測(cè)。

2.4 測(cè)序驗(yàn)證 中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)中查詢所得ITS2序列上游引物：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，下游：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR擴(kuò)增條件為94℃-5min；（94℃-30s，56℃-30s，72℃-45s）×30 cycle；72℃—10min；擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

3 結(jié)果與分析

3.1 焦磷酸測(cè)序結(jié)果 采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)進(jìn)行SNP分析。根據(jù)ITS2位點(diǎn)突變情況，得兩種峰圖，建澤瀉（含須根、葉柄、葉片）突變位點(diǎn)堿基為A（如圖1所示），川澤瀉（含須根、葉柄、葉片）突變位點(diǎn)堿基為T（如圖2所示），二者突變頻率均不小于83%（見表2）。

3.2 測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 測(cè)序序列與下載序列見表3，同時(shí)由圖3可以看出，建澤瀉ITS2序列與東方澤瀉一致，與澤瀉存在A-T突變；川澤瀉ITS2序列與澤瀉一致，與東方澤瀉存在A-T突變。有研究表明東方澤瀉與澤瀉在ITS2序列上的A-T變異是穩(wěn)定突變，因此可準(zhǔn)確鑒定這兩個(gè)物種[10]。故可判斷建澤瀉與東方澤瀉基源一致，即Alisma orientalis （Sam.）Juzep.

4 討論

實(shí)驗(yàn)采用焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)ITS2突變位點(diǎn)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)建澤瀉與川澤瀉在突變位點(diǎn)堿基不同，且毛細(xì)管電泳測(cè)序技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一結(jié)果，說明焦磷酸測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此本實(shí)驗(yàn)建立的基于ITS2突變位點(diǎn)的焦磷酸鑒定技術(shù)能準(zhǔn)確鑒定不同產(chǎn)地的澤瀉物種。與直接測(cè)序法相比，焦磷酸測(cè)序所用DNA不需要經(jīng)過凝膠電泳純化和熒光標(biāo)記，測(cè)序過程中可對(duì)測(cè)序結(jié)果實(shí)時(shí)觀察，同時(shí)能定性定量分析差異堿基，靈敏度高，操作便捷，適合已知序列的DNA短片段測(cè)序，是一種適用于中藥材的分子生物學(xué)鑒定手段。

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（收稿日期：2018-06-08 編輯：程鵬飛）