液體法聯(lián)合固體法同步培養(yǎng)在生殖道支原體檢測(cè)中的臨床應(yīng)用

葉丹 劉延一 姚艷蘭 吳博

支原體是介于細(xì)菌和病毒之間的一類無(wú)細(xì)胞壁, 形態(tài)呈高度多形性, 能在無(wú)生命培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖的最小的原核細(xì)胞型微生物［1］。支原體在自然界分布廣泛, 目前已分離出200余種, 寄居人體的有16種, 其中與泌尿生殖道感染相關(guān)的支原體有解脲支原體(U.urea-lyticum, Uu)、人型支原體(M.hominis, Mh)、生殖支原體(M.genitalium, Mg)。Uu和Mg是引起男性非淋菌性尿道炎的病原體［2］, Mh與產(chǎn)后發(fā)熱, 盆腔炎和細(xì)菌性陰道炎有關(guān)［3］。Uu和Mh主要通過(guò)體外培養(yǎng)進(jìn)行檢測(cè), 在臨床應(yīng)用比較廣泛。生殖支原體營(yíng)養(yǎng)要求高,在一般支原體培養(yǎng)基不生長(zhǎng)。由于培養(yǎng)難度大, 臨床主要通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)來(lái)檢測(cè)生殖支原體。支原體培養(yǎng)是目前國(guó)內(nèi)醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行Uu和Mh檢測(cè)的重要手段, 主要是使用液體培養(yǎng)基直接檢測(cè)并同時(shí)進(jìn)行支原體藥敏試驗(yàn)［4］,以達(dá)到盡早為臨床治療用藥提供依據(jù)的目的。但液體培養(yǎng)法有時(shí)候會(huì)受到細(xì)菌或真菌的污染導(dǎo)致假陽(yáng)性, 給臨床帶來(lái)誤診。固體培養(yǎng)是經(jīng)24~48 h小時(shí)后用顯微鏡直接觀察培養(yǎng)基上支原體屬典型的菌落形態(tài), 是診斷支原體感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”。作者對(duì)臨床收集的202份生殖道標(biāo)本進(jìn)行了兩種方法同步檢測(cè), 旨在發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)將檢測(cè)結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取2017年3月~2018年1月本院門(mén)診婦科、泌尿外科、皮膚性病科擬診為泌尿生殖道感染的202例患者, 其中男111例, 女91例；年齡18~73歲。嚴(yán)格按照采樣要求對(duì)男性采集尿道拭子, 女性采集宮頸分泌物后立即送檢。

1. 2 試劑與儀器 Uu和Mh選擇分離培養(yǎng)、鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)試劑盒, Uu和Mh選擇分離培養(yǎng)固體培養(yǎng)基(眾愛(ài)生河北生物科技有限公司), 力康HF240二氧化碳培養(yǎng)箱, 奧林巴斯CX23光學(xué)顯微鏡。

1. 3 方法 嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書(shū)操作完成液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)。24 h后觀察Uu、Mh在液體和固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況和并記錄；48 h后再觀察, Uu以24 h結(jié)果報(bào)告, Mh以48 h結(jié)果報(bào)告。當(dāng)液體培養(yǎng)變色, 固體培養(yǎng)沒(méi)有典型菌落生長(zhǎng)時(shí), 將液體培養(yǎng)基原液吸取10 μl轉(zhuǎn)種一塊新的固體培養(yǎng)基,24~48 h后顯微鏡下再觀察。

1. 4 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 觀察液體與固體培養(yǎng)基的結(jié)果差異, 以及液體陽(yáng)性、固體陰性的轉(zhuǎn)接結(jié)果。液體培養(yǎng)陽(yáng)性：培養(yǎng)24~48 h培養(yǎng)基有黃色變紅, 清亮無(wú)混濁。

固體培養(yǎng)陽(yáng)性：培養(yǎng)24~48 h時(shí), 鏡下放大40~100倍,可見(jiàn)Mh菌落較大, 為油煎蛋樣；Uu菌落小, 呈圓形棕褐色,且培養(yǎng)基由淺黃色變?yōu)闇\紅色。

1. 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示, 采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 同步培養(yǎng)結(jié)果 202份生殖道標(biāo)本液體培養(yǎng)檢出Uu陽(yáng)性84份, 陽(yáng)性率41.6%, 檢出Mh陽(yáng)性35份, 陽(yáng)性率17.3%；固體法培養(yǎng)檢出Uu陽(yáng)性61份, 陽(yáng)性率為30.2%, 檢出Mh陽(yáng)性20份, 陽(yáng)性率為9.9%。兩種培養(yǎng)法Uu和Mh陽(yáng)性率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1, 表2。

表1 兩種方法對(duì)Uu的檢出結(jié)果(份)

固體培養(yǎng)法 液體培養(yǎng)法合計(jì)陽(yáng)性 陰性陽(yáng)性 20 0 20陰性 15 167 182合計(jì) 35 167 202

2. 2 轉(zhuǎn)種后結(jié)果 23份液體培養(yǎng)陽(yáng)性、固體陰性的再轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)基有5份可見(jiàn)典型Uu菌落, 其中3份男性尿道標(biāo)本,2份女性宮頸分泌物標(biāo)本。

3 討論

支原體是泌尿生殖道感染常見(jiàn)的病原微生物, 與非淋菌性尿道炎、陰道炎, 前列腺炎, 宮頸炎和盆腔炎, 不孕不育等有關(guān)［5］, 其中Uu可引起精子畸形、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎等,準(zhǔn)確檢測(cè)支原體對(duì)臨床診斷和治療有十分重要的意義。

目前國(guó)內(nèi)醫(yī)院普遍開(kāi)展Uu和Mh的常規(guī)檢測(cè)和藥敏試驗(yàn), 幾乎均采用液體培養(yǎng)法［6,7］。液體法檢測(cè)原理基于Uu和Mh能分解培養(yǎng)液中的尿素和精氨酸產(chǎn)生堿性物質(zhì), 使含酚紅的培養(yǎng)液pH升高由黃色變成紅色, 培養(yǎng)液變紅即認(rèn)為有支原體生長(zhǎng)。多篇文獻(xiàn)均提到該方法有一定缺陷［8-10］, 這實(shí)際上是利用單一生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定, 但這一生化反應(yīng)并非支原體所特有, 泌尿生殖道內(nèi)定植的多種細(xì)菌和念珠菌會(huì)分解尿素或精氨酸使培養(yǎng)液變紅, 造成假陽(yáng)性。有研究表明［11］,變形桿菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌分解尿素是導(dǎo)致Uu培養(yǎng)假陽(yáng)性的主要原因。當(dāng)細(xì)菌濃度>103cfu/ml時(shí)對(duì)支原體培養(yǎng)結(jié)果影響較大, 且細(xì)菌濃度越高越容易影響支原體藥物敏感性判斷的準(zhǔn)確性, 而細(xì)菌濃度<103cfu/ml對(duì)支原體培養(yǎng)結(jié)果無(wú)影響。念珠菌中克柔念珠菌會(huì)分解尿素使pH升高, 但白色念珠菌不影響Uu的液體培養(yǎng)顯色［12］。除雜菌污染外, 泌尿生殖道外用藥物也會(huì)使培養(yǎng)基pH升高或降低造成支原體培養(yǎng)的假陽(yáng)性和假陰性。本次研究發(fā)現(xiàn), 如果以固體培養(yǎng)為標(biāo)準(zhǔn), 液體培養(yǎng)檢測(cè)Uu和Mh均有假陽(yáng)性出現(xiàn)。

傳統(tǒng)固體培養(yǎng)法是先經(jīng)液體培養(yǎng)疑似陽(yáng)性后再轉(zhuǎn)種固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24~48 h觀察有無(wú)典型支原體菌落再報(bào)告［13］。該方法雖可以保證支原體培養(yǎng)的準(zhǔn)確性, 但明顯延長(zhǎng)檢測(cè)的TAT(turnaroundtime)時(shí)間, 不能滿足門(mén)診病人的診斷和治療需求。本研究采用原始標(biāo)本同步接種液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)基,可明顯縮短培養(yǎng)的檢測(cè)周期。有研究顯示該固體培養(yǎng)基超過(guò)85%的支原體可在24 h內(nèi)看到典型菌落［14］。但固體培養(yǎng)基的敏感性不如液體培養(yǎng)基, 單獨(dú)使用固體培養(yǎng)基會(huì)造成漏檢, 轉(zhuǎn)種變紅的液體培養(yǎng)基可以彌補(bǔ)這一缺陷。需要注意的是, Mh在液體培養(yǎng)基中分解精氨酸, pH>7.8易死亡, 延遲轉(zhuǎn)種會(huì)導(dǎo)致固體培養(yǎng)假陽(yáng)性, 因此一旦觀察到液體變紅應(yīng)立即轉(zhuǎn)種。

綜上所述, 同步接種液體和固體培養(yǎng)基, 不僅能減少液體培養(yǎng)的假陽(yáng)性, 轉(zhuǎn)種疑似陽(yáng)性培養(yǎng)液還能提高固體培養(yǎng)基的敏感性, 兩者相互補(bǔ)充, 聯(lián)合使用能達(dá)到為臨床快速提供準(zhǔn)確檢驗(yàn)結(jié)果的目的。但聯(lián)合培養(yǎng)仍不能區(qū)分Uu的兩個(gè)亞型：Parvo生物型(Up)和T960生物型(Uu), Up常定植于健康人群。如果臨床沒(méi)有生殖泌尿系統(tǒng)感染癥狀, 即使分離出Uu, 也不能盲目使用抗生素, 以避免耐藥菌的產(chǎn)生。