鱸魚核型、Ag-NORs和C-帶分析

王曉艷，王世鋒，張建設(shè)，陳 治，吳常文，高天翔

（1.浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，國家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022；2.海南大學(xué)熱帶生物資源可持續(xù)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，海南?？?570228；3.中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院漁業(yè)生態(tài)學(xué)實驗室，山東青島 266003）

鮨科包括約62屬449個種類[1]，多數(shù)種類是重要的經(jīng)濟品種。鱸Lateolabrax japonicus，俗稱花鱸，體側(cè)有若干黑色斑點。為鱸形目Perciformes鮨科Serranidae鱸屬Lateolabrax，是近岸淺海中下層魚類，喜棲息于河口咸淡水交界處，肉食性，耐寒性較一般溫水魚強，水溫14℃以上時攝食[2]。

染色體是基因的載體。染色體研究可通過研究現(xiàn)有物種在染色體結(jié)構(gòu)上的差異來追溯其染色體進化，進而了解染色體結(jié)構(gòu)改變在物種進化分歧中的作用。魚類在漫長的進化過程中，形成了繁多的演化分枝，物種進化異?；钴S。王世鋒[3]認為魚類外部形態(tài)特征在不同環(huán)境或生理條件上常會發(fā)生顯著變化，所以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定并不能得到準確的分類。DE-AGUILAR，et al[4]提出鑒于細胞遺傳學(xué)可以揭示在形態(tài)學(xué)水平上不能體現(xiàn)的種屬間相似性和差異性，可能在進化分析方面起到重要作用。而到目前為止，絕大多數(shù)魚類的染色體研究局限于最基礎(chǔ)的層次——核型的研究，僅對魚類基因組中染色體的數(shù)目和形態(tài)進行描述。本研究采用采用胸腔活體注射PHA及秋水仙素溶液，取鱸魚頭腎細胞進行低滲處理，空氣干燥法制片。并對其進行Giemsa染色分析其核型，硝酸銀染色研究其核仁組織區(qū)（NORs），Ba（OH）2處理研究其異染色質(zhì)（C-帶），并對鮨科魚類核型研究情況作了統(tǒng)計和分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鱸魚4尾，性腺未成熟個體3尾，雌性個體1尾，購自浙江省舟山市普陀?xùn)|方水產(chǎn)養(yǎng)殖開發(fā)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 染色體標本制備[2]

參照王德祥等[5]的方法稍作修改。樣品個體按1 mL/100 g魚體重于尾靜脈抽血，胸腔注射植物血凝素（PHA）（20血，胸-6g/g[3]魚體重），3.5 h后以3以5A-6g/g魚體重注射秋水仙堿，15 min后剪鰓放血取頭腎。在0.85%生理鹽水中將頭腎剪碎，靜置，取上層細胞懸液1 000 r/min離心，收集的頭腎細胞重懸于0.075 mol/L的KCl溶液中，37℃低滲30 min。1 000 r/min離心收集細胞后用卡諾氏固定液（甲醇:冰乙酸=3:1，V/V）進行固定，連續(xù)固定3次，空氣干燥法制片。

1.2.2 核型分析

制備的染色體標本經(jīng)10%Giemsa染色20 min，蒸餾水沖洗，自然晾干后進行顯微觀察和拍照。選擇分散良好、形態(tài)清晰、兩條臂適當(dāng)分開且數(shù)目完整的中期分裂相約100個進行拍照。進行染色體計數(shù)、測量，并根據(jù)LEVAN，et al[6]的分類標準進行染色體配對、分組，其中染色體相對長度=（每一染色體長度/單套染色體組總長度）套染色體，臂比=長臂/短臂。

1.2.3 Ag-NORs（銀染核仁組織區(qū)）

按照HOWELL，et al[7]的方法略加修改。50%硝酸銀與20%明膠顯影液（內(nèi)含1%甲酸，V/V）按2:1（V/V）混勻后加于新制備1～2 d的標本上，加蓋蓋玻片，60℃溫浴至標本呈金褐色時迅速用蒸餾水沖洗以移除蓋玻片及殘留試劑，晾干后即可用于觀察，拍照。

1.2.4 C-帶

參照SUMNER[8]的方法略作修改。將老化1～2周的染色體標本，在0.2 mol/L HCl中處理30 min，漂洗晾干，置預(yù)熱至50℃的1%氫氧化鋇溶液中處理10～16 s，蒸餾水漂洗晾干，然后在62℃預(yù)熱的2×SSC中溫浴2 h后漂洗晾干，最后用10%Giemsa染色20 min，雙蒸水漂洗，晾干后即可用于觀察和拍照。

2 試驗結(jié)果及分析

2.1 染色體核型分析

對鱸魚92個分散良好的染色體中期分裂相進行觀察計數(shù)，觀察結(jié)果見表1。由表1可見鱸魚中期分裂相染色體總數(shù)為48的有83個，占分裂相總數(shù)的86.46%，由此可以判斷，鱸魚的二倍體染色體總數(shù)為48。表2中各染色體的相對長度是從10個良好中期分裂相中所得數(shù)據(jù)的均值，最長染色體為5.25，最短染色體為2.41，長度比為2.18，染色體相對長度順次減少。第12對染色體具次縊痕，最易辨認，其余各相鄰染色體對間長度差異不明顯，未發(fā)現(xiàn)異型性染色體。通過核型分析（表2可知鱸魚染色體核型為2n=48=48t，F(xiàn)N=48。鱸魚染色體的中期分裂相和核型圖，如圖1所示。

2.2 Ag-NORs

在所觀察的近200個中期分裂相中，發(fā)現(xiàn)鱸魚的Ag-NORs具有數(shù)目多態(tài)性和形態(tài)多態(tài)性（圖2）。其中數(shù)目多態(tài)性表現(xiàn)為：位于第12對同源染色體次縊痕處的Ag-NORs穩(wěn)定存在于每個中期分裂相中（圖2a）；第1對同源染色體其中1條染色體在部分中期分裂相中被銀染；甚至在部分分裂相中，幾乎所有染色體均能被不同程度銀染，這種現(xiàn)象尚未見報道（圖2b）。形態(tài)多態(tài)性主要表現(xiàn)為第12對染色體Ag-NORs大小及銀染強度。而在間期細胞中，出現(xiàn)1個和2個銀染位點的間期細胞最多，同時又有眾多位點被銀染的現(xiàn)象，如圖3所示。

表1 鱸魚染色體數(shù)目統(tǒng)計Tab.1 Chromosome numbers of L.japonicus

表2 鱸魚染色體相對長度及臂比Tab.2 The relative length and ratio of chromosome in L.japonicus

圖1 鱸魚染色體中期分裂相及核型Fig.1 The chromosome metaphase and karyotype of L.japonicus

2.3 C-帶

鱸魚大部分染色體具有微弱的C-帶，主要位于染色體著絲點位置。其中第1對染色體靠近著絲點位置具有明顯C-帶，部分染色體具有不穩(wěn)定的居間C-帶。第12對染色體次縊痕處為C-帶陰性（圖 4）。

3 討論

迄今為止，已有35種鮨科魚類進行過核型研究（表3），大多只進行了簡單的核型分析，帶型研究尚不多見，見表3。

在所統(tǒng)計的35種鮨科魚類二倍體染色體數(shù)均為48（2n=48），半數(shù)以上（19/35）為端部著絲粒染色體，而48條端部著絲粒染色體被認為是魚類的原始核型[4]。鮨科魚類的染色體核型結(jié)構(gòu)具有很強的趨同性和保守性，種類繁多的鮨科魚類的形成可能是在魚類進化過程中，染色體不斷重組和積累所造成的。鮨科魚類染色體臂數(shù)從48到96不等，其中4種魚類中出現(xiàn)了中部著絲粒染色體，如Centropristis ocyurus、Diplectrum eumelum、E.ftrio和E.merrt，這可能是由臂間倒位引起。18種魚被報道有次縊痕，而次縊痕位置有所不同，如S.fltviventris、Ptrtcentropristis hepttus、Serrtnus ctbrillt位于第1對染色體上；D.rtditle位于第3對染色體位置；Lateolabrax japonicus位于第12對位置；S.scribt位于第 16對染色體；Tlphestes tfer、E.tdscensionis、E.tlextndrinus、E.twotrt、E.ctninus、E.coioides、E.ftscittomtculosus、E.ftscittus、E.gutzt、E.mtltbtricus位于第24對染色體位置，次縊痕處為核仁組織區(qū)位置。Ag-NORs數(shù)目大多為1對處于靠近著絲粒位置，但在巖石斑魚E.tdscensionis中發(fā)現(xiàn)2對Ag-NORs，其中1對位于端粒位置。本文研究鱸魚的二倍體染色體數(shù)為48，第12對染色體上具次縊痕，與喻子牛等[32]的研究結(jié)果一致，銀染位點具有形態(tài)多態(tài)性和數(shù)目多態(tài)性，形態(tài)多態(tài)性表現(xiàn)為第12對染色體核仁組織區(qū)大小不同，銀染位點存在方式不同，數(shù)目多態(tài)性表現(xiàn)為中期分裂相中銀染位點的絕對數(shù)目及間期細胞核中銀染位點數(shù)目。

圖2 鱸魚的銀染中期分裂相Fig.2 The silver-staining metaphase of L.japonicus

圖3 鱸魚的銀染間期細胞核Fig.3 The silver-staining interphase nuclei of L.japonicus

圖4 鱸魚C-帶中期分裂相Fig.4 The C-banding metaphase of L.japonicus

表3 鮨科魚類染色體概況Tab.3 Review of the chromosome data in the family Serranidae

Ag-NORs表現(xiàn)為C帶陽性（異染色質(zhì)）這種現(xiàn)象在很多研究中均有報道，如鮨科的E.tlextndrinus、E.gutzt、點帶石斑魚 E.gtltbtricus、黑點副鋸鮨 Ptrtcentropristis hepttus、九帶鮨 Serrtnus ctbrillt、紋首鮨 S.scribt。但鱸魚的Ag-NORs為C帶陰性，而在第1對染色體靠近著絲粒位置卻發(fā)現(xiàn)了明顯的居間異染色質(zhì)帶，DE-AGUILAR，et al[4]在對5種鮨科魚類細胞遺傳學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)輻狀沙鮨D.radiale也具有相似的現(xiàn)象，認為這是由于NORs（核仁組織區(qū)）易位到其它染色體上，從而導(dǎo)致居間異染色質(zhì)與NORs不在同一位置。

在染色體進化方面，MARTíNEZ，et al[15]對鮨科5種魚類進行了C帶研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所研究的5種魚類異染色質(zhì)含量有減少的傾向，并認為這與魚類的進化方向一致，即通過丟失異染色質(zhì)區(qū)域中多余的DNA，朝較小的基因組和更特化的方向進化，同時染色體重組方式也導(dǎo)致了異染色質(zhì)的重新分布。鱸魚染色體表現(xiàn)為微弱的異染色質(zhì)帶，且并不是每條染色體均存在異染色質(zhì)帶，說明鱸魚是該科魚類中較特化的種類。

在鱸魚染色體銀染研究中還發(fā)現(xiàn)了非常有趣的現(xiàn)象，即眾多銀染位點的出現(xiàn)（某些中期分裂相中幾乎每個染色體均表現(xiàn)為不同程度的銀染陽性），這種現(xiàn)象在鮨科和石首魚科的研究中都未發(fā)現(xiàn)，而在一種鼻涕蟲Milax nigricans的研究中發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象[38]。本次研究進行了多次重復(fù)試驗，可以排除試驗誤差，仍發(fā)現(xiàn)有相似現(xiàn)象出現(xiàn)，而且在經(jīng)過C帶處理后也沒有對銀染位點造成顯著的減少，在標本放置兩個多月后進行銀染，多銀染位點現(xiàn)象仍然出現(xiàn)。其出現(xiàn)的原因可能是：（1）具翻譯活性的rDNA存在于每條染色體上，但在染色體中期這種活性大多會消失，而僅在某些特定染色體的核仁組織區(qū)顯示為銀染活性。這可以從間期細胞核中眾多銀染位點的存在得到佐證，但究竟是什么起到調(diào)控作用尚待進一步研究；（2）染色體進化過程中頻繁的易位所造成。