市售蒲公英片HPLC特征圖譜建立及其單咖啡酰酒石酸、菊苣酸 含量測(cè)定

余正勇 張艷 劉彬 桑苗　楊志斌　劉衡　趙昱　許傳坤

【摘 要】 目的：建立市售蒲公英片的HPLC特征圖譜并測(cè)定7個(gè)廠家蒲公英片中菊苣酸和單咖啡酰酒石酸的含量。方法：采用Sepax Gp-C18色譜柱（4.6×250 mm，5μm），0.1%三氟乙酸-乙腈和0.1%三氟乙酸-水為流動(dòng)系梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)323 nm。建立蒲公英片的特征圖譜，進(jìn)行相關(guān)性分析，并測(cè)定其單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的含量。結(jié)果：?jiǎn)慰Х弱＞剖岷途哲乃岬木€性范圍分別為10.2～204.0μg（R2=0.9999）和10.0～200.0 μg（R2=0.9999），回收率分別為100.11%和99.53%。建立了蒲公英片的特征圖譜，蒲公英片中9個(gè)共有峰在7個(gè)廠家中得到追蹤，并測(cè)定菊苣酸和單咖啡酰酒石酸的含量。結(jié)論：實(shí)驗(yàn)所建立的蒲公英片中菊苣酸和單咖啡酰酒石酸含量測(cè)定及特征圖譜方法穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可為蒲公英片的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供參考。

【關(guān)鍵詞】 蒲公英片；特征圖譜；菊苣酸；單咖啡酰酒石酸；含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）08-0037-06

Abstract：Objective To establish the HPLC methods for determining the contents of Caftaric acid and Chicoric acid and fingerprint chromatogram of taraxacum weber from market. Methods Chromatographic conditions for Sepax Gp - C18 chromatographic column （4.6x250 mm， 5 microns）， mobile phase consisted of 0.1% TFA - acetonitrile and 0.1% TFA - water at the flow rate of 1.0 mL/min， the column temperature was maintained 40 ℃. The detection wavelength was set at 323 nm to establish fingerprint chromatogram of taraxacum weber and aqueous decoction， and the content of Caftaric acid and Chicory acid were determined. Results The linear ranges of caftaric acid and chicoric acid were 4.08～204.0 μg（R2=0.9999）and 2.00～100.0 μg（R2=0.9999）， respectively. The average recoveries were 100.11% and 99.53% ， respectively. The fingerprints of the taraxacum weber were established， and the 9 common peaks in the taraxacum weber were tracked in 7 different manufacturers and the contents of Caftaric acid and Chicoric acid were determined. Conclusion The methods can provide more information for the quality control of taraxacum weber formula granules.

Keywords：Taraxacum Weber； Formula Granule； Chicoric Acid； Caftaric Acid；Content Determination

蒲公英又名婆婆丁、黃花地丁、黃花三七等，為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz、堿地蒲公英Taraxacum borealisinense Kitag.或同屬數(shù)種植物的干燥全草。蒲公英中含有黃酮類、酚酸類、萜類、色素類植物甾醇類等化合物[1]，具有抗炎、抑菌、保肝、抗腫瘤、抗氧化、降糖等作用[2-5]，常用于治療疔瘡腫毒、乳癰、目赤、肺癰、腸癰、濕熱黃疸和熱淋澀痛等癥[6]。蒲公英片是以蒲公英水提醇沉干浸膏制得，具有清熱解毒的功效，主要用于咽喉腫痛（急性扁桃體炎）、瘡癤[1]，收載于部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第三冊(cè)，但該標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)蒲公英片做相關(guān)的含測(cè)要求，對(duì)該品種的質(zhì)量控制缺乏全面性和客觀性[7]。中藥特征圖譜可以通過(guò)系統(tǒng)性、整體性和特征性等特點(diǎn)評(píng)價(jià)蒲公英中所含化學(xué)成分的種類及數(shù)量，對(duì)于蒲公英片的質(zhì)量控制具有重要意義[8]。近年來(lái)，有部分關(guān)于蒲公英藥材的特征圖譜研究相繼報(bào)道，分別以其藥材中綠原酸、咖啡酰、阿魏酸、蘆丁、木犀草素等常見(jiàn)酚酸類化學(xué)成分進(jìn)行特征圖譜指認(rèn)[9-10]，但是尚未建立蒲公英片主要特征峰的HPLC特征圖譜及含量測(cè)定方法。

筆者對(duì)市售7個(gè)廠家的蒲公英片展開(kāi)特征圖譜研究，采用“中藥特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）對(duì)其進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，并首次確認(rèn)蒲公英片特征圖譜中的特征峰單咖啡酰酒石酸和菊苣酸，對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，為蒲公英片的質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)為后續(xù)藥理活性研究提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BSA124S分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；AKSW-V-16艾柯實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（成都艾柯水處理設(shè)備有限公司）；Agilent 1260型高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)Agilent 公司）；Sepax Gp-C18色譜柱（4.6×250mm，5μm，美國(guó)賽分）； 已腈、三氟乙酸為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 材料 對(duì)照品菊苣酸（批號(hào)：20140704，99.3%，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；單咖啡酰酒石酸（批號(hào)：PRF8052505，純度>98%，成都柯瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司）。市售7個(gè)廠家的蒲公英片，均執(zhí)行部頒標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第三冊(cè)WS3-B-0648-91，標(biāo)示量均為每片含干浸膏0.3克，分別產(chǎn)自河南A廠（批號(hào)：1607023）、河南B廠（批號(hào)：160509）、河南C廠（批號(hào)：160301）、河南D廠（批號(hào)：160305）、廣西E廠（批號(hào)：150420）、山西F廠（批號(hào)：20151002）、吉林G廠（批號(hào)：04160303）。

2 方法與結(jié)果

2.1 單咖啡酰酒石酸與菊苣酸含量測(cè)定

2.1.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取單咖啡酰酒石酸5.1 mg、菊苣酸5.0 mg于25 mL棕色量瓶中，加入超純水定容至刻度，搖勻，即得204 μg/mL的單咖啡酰酒石酸和200 μg/mL菊苣酸的對(duì)照品溶液，分別取混標(biāo)溶液0.5、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL量瓶中，加入超純水定容致刻度線，搖勻，既得系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.1.2 供試品溶液的配制 取各廠家蒲公英片20片，去除包衣后研碎，精密稱取該粉末400.0 mg于具塞錐形瓶中，精密加入70 %乙醇10 mL，稱重，超聲處理（功率300 W，頻率54 Hz）30 min，放冷，稱重，用70%乙醇補(bǔ)足差重，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液1.0 mL過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得濃度為40 mg/mL供試品溶液。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Sepax Gp-C18 （4.6×250 mm，5μm）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：323 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸-乙腈，流動(dòng)相B為0.1%三氟乙酸-水，洗脫梯度：0～13 min，11%A 等梯度洗脫；14～22 min，17%A等度洗脫；22～29 min，17%～27%A梯度洗脫；29～43 min，27%～34%A梯度洗脫；43～50 min，34%～95%A梯度洗脫。理論塔板數(shù)按菊苣酸峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。取混合對(duì)照品溶液、空白溶液及供試品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果表明，供試品及混合標(biāo)準(zhǔn)品中各峰分離度及對(duì)稱性良好，色譜圖如圖1所示。

2.1.4 線性關(guān)系試驗(yàn) 取系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（μg），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表1。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的峰面積的RSD分別為1.09%、1.44%，表明精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取山西F廠（批號(hào)：20151002）蒲公英片，各精密稱量6份，按2.1.2項(xiàng)下配制供試品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積并代入表1標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算樣品中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的含量（μg/mg）。結(jié)果顯示單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的平均含量分別為1.43 μg/mg、1.29 μg/mg，RSD值分別為0.99%、1.09%，表明重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取山西F廠（批號(hào)：20151002）蒲公英片供試品溶液，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果顯示24 h內(nèi)單咖啡酰酒石酸峰面積的RSD為0.67%；菊苣酸峰12h內(nèi)的面積的RSD為0.61%，即供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 加樣回收試驗(yàn) 取山西F廠（批號(hào)：20151002）蒲公英片，各精密稱量6份，精密加入對(duì)照品溶液，按2.1.2項(xiàng)下配制供試品溶液，測(cè)定單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.1.9 供試品測(cè)定 取7個(gè)廠家的蒲公英片，按“2.1.2”項(xiàng)下方法配置供試品溶液，精密吸取各供試品溶液10 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件記錄單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的峰面積，并計(jì)算其含量，見(jiàn)表3。

2.2 特征圖譜的測(cè)定與相似度分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Sepax Gp-C18 （4.6×250mm，5μm）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：323 nm；柱溫：40 ℃；流動(dòng)相A為0.1%三氟乙酸-乙腈，流動(dòng)相B為0.1%三氟乙酸-水，洗脫梯度：0～13 min，11%A 等梯度洗脫；14～22 min，17%A等度洗脫；22～29 min，17%～27%A梯度洗脫；29～43 min，27%～34%A梯度洗脫；43～50 min，34%～95%A梯度洗脫。

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn) 取山西F廠（批號(hào)：20151002）蒲公英片，各精密稱量1份，按“2.1.2”項(xiàng)下配制供試品溶液，平行測(cè)定6次，以單咖啡酰酒石酸峰和菊苣酸峰為參照峰，計(jì)算其余各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，RSD<2%，符合HPLC特征圖譜檢驗(yàn)要求，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取山西F廠（批號(hào)：20151002）蒲公英片供試品溶液，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)行進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以單咖啡酰酒石酸峰和菊苣酸峰為參照峰，計(jì)算其余各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間在12 h內(nèi)無(wú)明顯變化，RSD<2%，表明供試品溶液在室溫條件下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取山西F廠（批號(hào)：20151002）蒲公英片，各精密稱量6份，按“2.1.2”項(xiàng)下配制供試品溶液，平行測(cè)定，以單咖啡酰酒石酸峰和菊苣酸峰為參照峰，計(jì)算其余各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果各特征峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間無(wú)明顯變化，RSD<2%，符合HPLC特征圖譜檢驗(yàn)要求，表明重復(fù)性良好。

2.2.5 蒲公英片特征圖譜測(cè)定 按“2.1.3”項(xiàng)色譜條件對(duì)7個(gè)廠家生產(chǎn)的蒲公英片進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖2。采用“中藥特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件得出色譜峰1～9為7個(gè)不同廠家蒲公英片的共有峰，依次確認(rèn)色譜峰1～9為蒲公英片的特征峰，并且在相同HPLC條件下，3、4、5、6、7的保留時(shí)間分別與沒(méi)食子酸、單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸對(duì)照品的保留時(shí)間一致，其中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸分離度較好，且含量較高、穩(wěn)定，故選擇單咖啡酰酒石酸和菊苣酸為參照峰（S）。

2.2.6 特征圖譜的相關(guān)性分析 將“2.2.1”項(xiàng)下所得色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件，采用多點(diǎn)校正將譜峰自動(dòng)匹配，平均數(shù)法設(shè)置參照?qǐng)D譜，峰匹配模式得出樣品特征譜圖的共有峰，并計(jì)算相似度，結(jié)果見(jiàn)圖3和表4。由表4可見(jiàn)，7個(gè)廠家生產(chǎn)的蒲公英片中，除河南D廠樣品相似度為0.831外，其余樣品相似度均>0.90，差異不明顯，并且1～9色譜峰在7個(gè)廠家生產(chǎn)的蒲公英片中均能全部檢出，表明各廠家生產(chǎn)的蒲公英片成分相關(guān)性良好，該色譜條件建立的蒲公英片的特征圖譜指標(biāo)穩(wěn)定。

3 討論

3.1 單咖啡酰酒石酸和菊苣酸作為指標(biāo)峰用于蒲公英片的特征圖譜 在蒲公英原料藥材及其制劑的相關(guān)報(bào)道檢索中少見(jiàn)有對(duì)單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的報(bào)道[11]，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在蒲公英片中，單咖啡酰酒石酸和菊苣酸有較高的含量、特征性良好，故選取單咖啡酰酒石酸和菊苣酸作為蒲公英片的含測(cè)指標(biāo)及蒲公英片特征圖譜的指標(biāo)峰。結(jié)果表明，蒲公英片在0.1%的TFA乙腈和0.1%TFA水作為流動(dòng)相時(shí)具有較好的分離效果，能夠保證樣品良好的分離度和出峰數(shù)。特征圖譜研究中發(fā)現(xiàn)，蒲公英片中富含酚酸類物質(zhì)，其中沒(méi)食子酸、單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸的含量較高，且均為咖啡酸類衍生物，故選取咖啡酸的特征吸收波長(zhǎng)323 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，且在該波長(zhǎng)下各峰分離度良好，特征性強(qiáng)，峰數(shù)目較多。

3.2 市售7個(gè)廠家蒲公英片的特征圖譜比較分析 對(duì)比分析7個(gè)廠家的蒲公英片發(fā)現(xiàn)，除河南D廠外，其余6個(gè)廠家的蒲公英片具有較高的相似度。通過(guò)“中藥特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”軟件進(jìn)行峰匹配發(fā)現(xiàn)7個(gè)廠家生產(chǎn)的蒲公英片中均含有沒(méi)食子酸、單咖啡酰酒石酸、綠原酸、咖啡酸、菊苣酸，且單咖啡酰酒石酸和菊苣酸含量較高，特征性明顯，特征指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間一致，表明該方法用于蒲公英片的特征圖譜具有較高的穩(wěn)定性。河南D廠相似度相對(duì)較低可能是原料藥材的選取、原料藥材的質(zhì)量控制或原料藥材的采收季節(jié)、產(chǎn)地、儲(chǔ)存方式等方面的原因，但缺乏實(shí)驗(yàn)論證。

3.3 單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的含量比較 《中國(guó)藥典》2015版僅在蒲地藍(lán)消炎口服液中有測(cè)定蒲公英中菊苣酸含量的記載，尚無(wú)單咖啡酰酒石酸的相關(guān)指標(biāo)考察[7]。研究表明，蒲公英中的單咖啡酰酒石酸和菊苣酸具有增強(qiáng)免疫、抗炎、抗氧化等作用[11]。測(cè)定蒲公英片中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸含量發(fā)現(xiàn)，河南D廠生產(chǎn)的片劑中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸含量分別為0.39 mg/g和0.12 mg/g，其余6個(gè)廠家的蒲公英片中單咖啡酰酒石酸和菊苣酸含量均高于1.00 mg/g和0.80 mg/g，這可能也是導(dǎo)致河南D廠與其余6廠相似度差別較大的原因之一。單咖啡酰酒石酸和菊苣酸在蒲公英片中有較高的含量和明顯的HPLC特征圖譜，因此，可將單咖啡酰酒石酸和菊苣酸作為蒲公英及其相關(guān)制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)之一，但是單咖啡酰酒石酸和菊苣酸的含量與蒲公英片的療效之間的關(guān)系尚需藥理實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

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（收稿日期：2018-03-14 編輯：鄧佳麗）