海狗丸的體外活性研究

賈福懷 季存蕊 涂宏建 晏永球 陶剛 王俊 雷蕾

【摘 要】 目的：從細(xì)胞水平上探索海狗丸的壯陽生精活性，為海狗丸的藥效研究提供參考和依據(jù)。方法：采用MTT比色法和生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，考察海狗丸不同給藥濃度對大鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞增值及睪酮分泌的影響。結(jié)果：海狗丸在50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL的給藥濃度下，均具有促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖和睪酮分泌的作用，且促進(jìn)作用隨著給藥濃度的增大而增強(qiáng)。結(jié)論：海狗丸具有一定的壯陽生精活性。

【關(guān)鍵詞】 海狗丸；睪丸間質(zhì)細(xì)胞；MTT比色法；生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法

【中圖分類號】R-332 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）15-0013-04

Abstract：Objective From the cellular level， the aphrodisiacspermatogenic activity of the Sea Dog Pills was explored， which provided references and basis for the study on the efficacy of the Sea Dog Pills.Methods MTT colorimetry and biotin double-antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay were used to investigate the effect of different doses of Sea Dog Pills on Leydig cells proliferation and testosterone secretionin rats.Results At the concentrations of 50 μg/mL， 100 μg/mL and 200 μg/mL， the Sea Dog Pills all have the effect of promoting Leydig cell proliferation and testosterone secretion， and the promotion effect increases with the increase of the drug concentration.Conclusion The Sea Dog pill has a certain aphrodisiac spermatogenic activity.

Keywords：Sea Dog Pill；Leydig Cell； MTT；ELISA

海狗丸是由海狗、枸杞子、益智、山藥、蠶蛹和肉桂六味藥物組成的復(fù)方制劑，具有抗疲勞的保健功效。海狗丸中的君藥為海狗，本實驗所用海狗丸選用加拿大紐芬蘭養(yǎng)殖區(qū)海狗的海狗鞭入藥。海狗鞭具補(bǔ)腎固元、補(bǔ)血益氣、抗衰益壽等多種功效。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞主要功能是合成、分泌睪酮[1]，是睪丸中分泌睪酮的主要細(xì)胞，而睪酮在精子發(fā)生中起重要作用，其分泌活動主要由下丘腦、垂體及自身調(diào)節(jié)作用控制。睪丸間質(zhì)細(xì)胞的研究無論在男性的生殖健康，還是機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)，以及內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)方面都具有重要的地位[2-3]。研究結(jié)果表明：腎陽虛證患者通常存在腎上腺功能紊亂、甲狀腺功能紊亂、性腺功能紊亂、垂體功能紊亂等內(nèi)分泌失調(diào)現(xiàn)象[4-6]，故將腎陽虛證定位在下丘腦-垂體-靶腺軸（腎上腺、甲狀腺、性腺）上。其中能夠反映下丘腦-垂體-性腺軸的功能異常的主要指標(biāo)包括血清睪丸酮（T）下降，雙氫睪酮（DHT）降低，血清雌二醇（E2）升高[7]；同時當(dāng)此性腺軸功能異常時，還會伴隨著睪丸、前列腺、精囊腺等器官出現(xiàn)組織學(xué)改變。研究采用MTT比色法和生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），考察海狗丸對大鼠的睪丸間質(zhì)細(xì)胞增值及睪酮（T）分泌的影響，從細(xì)胞水平上探索海狗丸的壯陽生精活性，為海狗丸的藥效研究提供參考和依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 HERAEUSHERAcell 150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；SW-CJ-1CU雙人單面超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；METTLER TOLEDO 電子天平（SARTORIUS AG）；細(xì)胞成像倒置顯微鏡（奧林巴斯公司）；Model 680型酶標(biāo)儀（日本TAKARA公司）。

1.2 藥物 海狗丸（批號：B17170001，寧波御坊堂生物科技有限公司）。

1.3 動物 Wistar大鼠，SPF級，雄性，11～12周齡，體重 260～280g，許可證號：SYXK（京）2017-0022。

1.4 試劑 胎牛血清、D-MEM / F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液均購于Gibco公司；Ⅰ型膠原酶和MTT均購于Sigma公司；人絨毛膜促性腺激素（HCG）購于寧波第二激素廠；大鼠睪酮（T）酶聯(lián)免疫吸附測定檢測試劑盒（ELISA）購于RAD公司。

2 方法

2.1 藥物制備 將海狗丸樣品用剪刀剪碎，電子天平精密稱定0.001g后置于1mL容量瓶中，然后加入D-MEM /F12培養(yǎng)基溶解并定容，得到濃度為1mg/mL的供試品溶液。再將上述供試品溶液用0.22μm的濾膜過濾除菌，所得濾液待用且藥物制備在細(xì)胞給藥前配置。

2.2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞懸浮液的制備 依據(jù)參考文獻(xiàn)[8-10]結(jié)合實驗室條件進(jìn)行實驗方法學(xué)研究和設(shè)計，主要研究確定了細(xì)胞離體培養(yǎng)的時間、細(xì)胞換液的時間和次數(shù)、細(xì)胞鋪板的密度、海狗丸的給藥濃度、給藥后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)的時間等實驗參數(shù)，對參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行改進(jìn)。將Wistar大鼠用10%水合氯醛麻醉，脫椎處死后用75%乙醇浸泡10min，置于已滅菌處理的培養(yǎng)皿中，在無菌狀態(tài)下用眼科剪和鑷剪剖開下腹，除去睪丸外層的附睪組織，取出一側(cè)完整的睪丸后，用預(yù)冷的PBS（0.01mol/L，pH7.2）緩沖液進(jìn)行沖洗后除去白膜，置0.05% I型膠原酶（約用10mL）中輕輕吹打數(shù)次，使組織分散，37℃震蕩水浴消化30min。加入等體積含10%胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)液終止消化，然后用吸管吹打，使睪丸間質(zhì)細(xì)胞充分散開。用4層紗布過濾，收集濾液，在1000r/min條件下離心10min，沉淀的細(xì)胞加入培養(yǎng)基吹打沖洗細(xì)胞中殘留的消化液，低速（1000r/min） 離心10min，棄上清。用含10%胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)基10mL吹打成均勻的懸浮細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶中。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱條件下內(nèi)培養(yǎng)36h，待睪丸間質(zhì)細(xì)胞貼壁，傾出培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗至瓶壁上沒有漂浮細(xì)胞，再加入培養(yǎng)液培養(yǎng)2d，此培養(yǎng)時間是由方法學(xué)考察后確定的。

定時觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，選取對數(shù)期細(xì)胞用于實驗；當(dāng)細(xì)胞生長到鏡下觀察覆蓋80%～90%、細(xì)胞伸展成不規(guī)則形態(tài)時，用0.25%胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化，至細(xì)胞縮成小圓形并呈現(xiàn)部分輕輕浮動現(xiàn)象時，終止消化，棄去消化液。然后向其中加入5mL培養(yǎng)基，用吸管吹下貼壁的Leydig細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞活度測定后，準(zhǔn)備鋪板。前期已對細(xì)胞鋪板密度進(jìn)行考察，將細(xì)胞鋪板密度定為105個/mL。用含有10%胎牛血清的D-MEM/F12培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至105個/mL，取100μL/孔的細(xì)胞懸浮液接種于96孔板（鋪板），放入37℃、5%CO2 的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2d，給藥進(jìn)行實驗。

其中在細(xì)胞活力檢測階段：截取時間點分別為4h、12h、24h、48h、72h、96h、120h，分別給每孔加入20μL MTT試液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，將液體倒出，每孔加入100μL DMSO，置于酶標(biāo)儀震蕩10min，在490nm波長下測定吸光度，以吸光度OD值為縱坐標(biāo)、時間為橫坐標(biāo)，繪制睪丸間質(zhì)細(xì)胞的生長曲線，如圖1所示。

由生長曲線可知：細(xì)胞處于正常生長狀態(tài)，在72h左右，細(xì)胞處于穩(wěn)定的狀態(tài)，在24～72h細(xì)胞基本處于對數(shù)生長期。

2.3 MTT法考察海狗丸對Leydig細(xì)胞的增殖作用

2.3.1 MTT的配制 稱取MTT0.25g，溶于50mL的磷酸緩沖液（PBS），用0.22μm濾膜過濾除菌，取實驗用量，放4℃避光保存?zhèn)溆?。其余在無菌條件下，分裝1.5mL到2mL EP管，置-20℃長期保存。

2.3.2 實驗步驟 將鋪板后的睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)2天后，棄去培養(yǎng)液，按實驗分組對細(xì)胞進(jìn)行給藥處理。樣品組每組分別加入海狗丸供試品溶液100μL/孔（濃度分別為50μg/mL、100g/mL、200μg/mL），每個樣品濃度設(shè)5個復(fù)孔?？瞻讓φ战M加入D-MEM/F12培養(yǎng)液100μL/孔，設(shè)5個復(fù)孔。陽性組加入含人絨毛膜促性腺激素（HCG）的D-MEM/F12培養(yǎng)液（含HCG終濃度為1U/mL）100μL/孔，設(shè)5個復(fù)孔。在37℃、含5%CO2條件下培養(yǎng)24h后向每孔加入5mg/mL的 MTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h。取出培養(yǎng)板，將96孔培養(yǎng)板傾斜約30度角，小心吸去上清液后將每孔加入100μL的DMSO，并立刻轉(zhuǎn)移至酶標(biāo)儀中在37℃振蕩10min后測定490nm下的OD值[11]。

按公式計算睪丸間質(zhì)細(xì)胞增值率：

細(xì)胞增殖率（%）=（實驗孔OD值-空白孔OD值）/ 空白孔OD值× 100%

2.4 ELISA法測定Leydig細(xì)胞分泌的睪酮含量 參照文獻(xiàn)方法[12-13]進(jìn)行前期方法學(xué)研究，對參考文獻(xiàn)方法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化。其中主要確定了細(xì)胞的鋪板密度，以及睪酮濃度與OD值呈線性的線性范圍。將細(xì)胞密度為105個/mL的睪丸間質(zhì)細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中（100μL/孔），于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d后輕輕吸去培養(yǎng)液后給藥。樣品組每組分別加入海狗丸供試品溶液100μL/孔（濃度分別為50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL），設(shè)5個復(fù)孔。空白對照組加入D-MEM/F12培養(yǎng)液100μL/孔，設(shè)5個復(fù)孔。陽性對照組加入含人絨毛膜促性腺激素（HCG）的D-MEM/F12培養(yǎng)液（含HCG終濃度為1U/mL）100μL/孔，設(shè)5個復(fù)孔。給藥后置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，并檢測給藥24h后大鼠Leydig細(xì)胞分泌的睪酮含量，按照大鼠睪酮（T）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書逐步進(jìn)行實驗，用酶標(biāo)儀測定吸光值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 利用軟件SPSS 19.0處理研究數(shù)據(jù)，用（x±s）表示所得數(shù)據(jù)，組間差異比較采用t檢驗，P<0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 睪丸間質(zhì)細(xì)胞活性實驗結(jié)果 本實驗采用MTT法檢測Leydig細(xì)胞增殖情況，得到海狗丸3個給藥濃度對睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖影響情況見表1。在給藥24h后，3個給藥濃度的海狗丸樣品均對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用，且促進(jìn)作用隨給藥濃度升高而增強(qiáng)。其中低（50μg/mL）、中（100μg/mL）給藥濃度的海狗丸樣品的作用不明顯，與空白對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；而高濃度給藥實驗組（200μg/mL）、陽性對照組分別與空白對照組相比較，存在極顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），說明對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用強(qiáng)。

3.2 ELISA法測定Leydig細(xì)胞分泌的睪酮含量實驗結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 利用試劑盒做睪酮標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=0.0343x+0.6566，R2=0.9995。檢測睪酮濃度在1.0～32.0nmol/L時與OD值呈線性關(guān)系，如圖1所示。

3.2.2 睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌睪酮的含量 將測得的OD值用標(biāo)準(zhǔn)曲線算出睪酮含量，并與空白對照組進(jìn)行獨立樣本t檢驗。結(jié)果顯示給藥24h后，陽性對照組（HCG）和海狗丸實驗組（高、中、低3個濃度）與空白組相比，均不同程度的促進(jìn)了睪丸間質(zhì)細(xì)胞的睪酮分泌量，見表2。在給藥24h后，3個給藥濃度的海狗丸樣品，均具有促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌的作用，且促進(jìn)作用隨給藥濃度增高而增強(qiáng)。分別與空白對照組相比較：其中低給藥濃度（50μg/mL）作用不明顯，無統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；中給藥濃度（100μg/mL）就存在統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；而在200μg/mL高給藥濃度時，促進(jìn)睪酮分泌的作用已優(yōu)于1U/mL陽性對照（HCG），與空白組相比較有極顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。

4 討論

睪丸間質(zhì)細(xì)胞分布于生精小管的結(jié)締組織中，主要具有合成和分泌睪酮的功能，其分泌睪酮的形式有基礎(chǔ)分泌和促性腺激素誘導(dǎo)分泌兩種。睪酮對于人類生長發(fā)育、促進(jìn)性欲以及精子的生成進(jìn)而提高生育力等都具有十分重要的作用。鑒于睪酮在增強(qiáng)人體力量、性欲、免疫等功能的重要影響，且95%的血漿睪酮是由睪丸Leydig細(xì)胞分泌的[14]，故海狗丸的壯陽生精活性與睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增值和睪酮分泌密切相關(guān)。研究采用體外培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用不同給藥濃度的海狗丸樣品處理，觀察對睪丸間質(zhì)細(xì)胞基礎(chǔ)分泌的變化和對細(xì)胞增殖情況的影響。

通過建立體外培養(yǎng)大鼠 Leydig 細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法，以MTT法考察海狗丸對Leydig細(xì)胞的增殖作用，以ELISA方法檢測海狗丸對細(xì)胞培養(yǎng)上清液中睪酮含量的影響，來考察海狗丸的體外壯陽生精活性。實驗結(jié)果顯示，在設(shè)計劑量范圍內(nèi)，隨著給藥濃度的增加，對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，其低（50μg/mL）、中（100μg/mL）給藥濃度的海狗丸樣品與空白對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05），而高濃度（200μg/mL）給藥時就存在極顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P < 0.01）。此外，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中睪酮的含量也隨給藥濃度的增加逐漸增加，且與空白對照組相比，100μg/mL、200μg/mL給藥濃度時有統(tǒng)計學(xué)差異（P< 0.05）。由實驗結(jié)果可知，一定濃度的海狗丸細(xì)胞給藥后能促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增值和睪酮（T）的分泌，給藥濃度的增大其促進(jìn)作用也越明顯。結(jié)果可知，海狗丸產(chǎn)品確實有一定的壯陽生精活性，為海狗丸的藥效研究提供參考和實驗支持。

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