云南松松針?biāo)幉馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

張志琴 郭向群 聶奇華

【摘 要】 目的：制定松針?biāo)幉牡馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為藥用植物資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。方法：浸出物測定法，灰分測定法，水分測定法，薄層色譜法及高效液相色譜法。結(jié)果：對不同產(chǎn)地及收集時(shí)間云南松松針的浸出物、總灰分、酸不溶性灰分和水分進(jìn)行了測定；同時(shí)對其活性成分山柰酚進(jìn)行了薄層定性鑒別和高效液相色譜法定量研究。結(jié)論：通過研究制定了松針?biāo)幉牡馁|(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

【關(guān)鍵詞】 松針；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；山柰酚；薄層色譜法；高效液相色譜法

【中圖分類號】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）09-0010-04

Abstract：Objective To provide scientific basis for the utilization and development of Pine needle. Method The extract of pine needle was examined Moisture and ash were determined. And the active component were analyzed by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography. Results Content of total ash， acid insoluble ash， and moisture of pinus yunnanensis from different areas and times were determined. The qualitative and quantitative analysis of kaempferol by thin layer chromatography and high performance liquid chromatography were performed respective. Conclusion The established method can be used for the quality specification of Pine needle.

Keywords：Pine needle； Quality specification； Kaempferol； Thin layer chroma- tography； HPLC

松針（pine needle），別名豬鬃松毛、松毛、山松須，為松科松屬植物的針狀葉。松針是我國傳統(tǒng)中藥，在歷代本草中均有記載。《別錄》謂其：“主風(fēng)濕瘡，生毛發(fā)，安五臟”?！侗静菥V目》記載：“松針，氣味苦、溫、無毒，久服令人不老，輕身益氣，主風(fēng)濕瘡，生毛發(fā)，安五臟，守中，不饑延年”[1]。現(xiàn)代研究表明，松針具有鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗突變、降血脂、降血壓、抑菌等作用，其利用價(jià)值日益受到關(guān)注[2-4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，松針中含有山柰酚等黃酮類成分[5]，山柰酚在防癌、抗癌、抗感染、抗炎及免疫抑制等方面有重要作用[6]。另外，山柰酚還能夠降低血糖，改善胰島素抵抗[7]。本研究對云南松松針中所含該活性成分采用TLC及HPLC進(jìn)行了定性、定量研究，并對藥材的水分、灰分、浸出物進(jìn)行了測定，為制定松針的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、開發(fā)新藥奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-20A高效液相色譜儀（日本島津）；Sartorius BS 224S萬分之一分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）；SX2-4-10箱式電阻爐（上海-恒科學(xué)儀器有限公司）；索氏提取器；As10200型超聲波清洗機(jī)（北京華博科技制造有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠）。

1.2 材料 硅膠G預(yù)制薄層板（批號20141006，青島海洋化工廠，100mm×100mm）；HPLC級乙腈（德國MERCK公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純；山柰酚對照品（批號MUST-13121112，成都曼思特生物科技有限公司）。松針?biāo)幉?批，分別產(chǎn)自楚雄（2批）、南華、永仁、牟定、大姚、祿勸、大理、巍山。經(jīng)楚雄醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校生藥教研室姚榮林教授鑒定為云南松（Pinus yunnanensis Franch）松針。

2 方法及結(jié)果

2.1 水分、總灰分、酸不溶性灰分和浸出物的測定

2.1.1 測定方法[8] 水分測定參照2015年版《中華人民共和國藥典》四部0832項(xiàng)下水分測定法中第二法（烘干法）；總灰分、酸不溶性灰分測定參照2302項(xiàng)下灰分測定法；浸出物測定參照2201項(xiàng)下浸出物測定法，以乙醇為溶劑，采用熱浸法測定醇溶性浸出物。

2.1.2 測定結(jié)果 9批樣品的水分、總灰分和酸不溶性灰分、浸出物的測定結(jié)果見表1。9批云南松松針?biāo)幉乃值钠骄繛?1.25%，總灰分的平均含量為3.28%，酸不溶性灰分的平均含量為0.27%，醇溶性浸出物的平均含量為20.83%。依照《中國藥典》中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究制定技術(shù)要求，按其平均值的±20%作為限度的制定幅度，暫定云南松松針?biāo)幉乃趾坎坏贸^13.50%，總灰分不得超過3.94%，酸不溶性灰分不得超過0.32%，醇溶性浸出物不得少于16.66%。

2.2 松針的薄層色譜（TLC）鑒別 取云南松松針粉末2g，加甲醇-20%鹽酸（4∶1）混合溶液50 mL，回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取山柰酚對照品，加甲醇制成1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶5∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁顯色，在紫外燈（365 nm）下檢識，山柰酚熒光斑點(diǎn)清晰，分離效果理想。薄層色譜圖如圖1所示。

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：InertSustainC18（250mm×4.6mm， 5μm）；流動相：乙腈∶0.3%磷酸水溶液（30∶70）；流速：1 mL/min；柱溫：40℃；檢測波長：365 nm，進(jìn)樣量：10 μL。色譜柱的理論板數(shù)按山柰酚計(jì)算應(yīng)不低于6000，分離度大于1.5。如圖2所示。

2.3.2 對照品溶液制備 取山柰酚對照品9 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加流動相甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，使成為0.9602 mg/mL的對照品儲備液。

2.3.3 供試品溶液的制備 稱取云南松松針粉末（4號篩）約1.0 g，精密稱定，各加入甲醇-20%鹽酸（4∶1）混合溶液25 mL，加熱回流提取2次，每次1.5 h，合并濾液并定容至50 mL量瓶中，用0.45 μm濾膜過濾，備用[9]。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密量取對照品儲備液1.0 mL置10 mL量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，配成0.09602mg/mL的對照品；分別精密吸取上述對照品溶液2、4、6、8、10 μL按上述色譜條件依次進(jìn)樣，以山柰酚進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y=5×106X-9184.3，r=0.9998，山柰酚在0.19～0.96 μg范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。如圖2所示。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取山柰酚對照品溶液（0.09602mg/mL）10 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄山柰酚色譜峰峰面積RSD為0.84%，顯示具有良好的精密度。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.3.3”項(xiàng)下操作，處理同一樣品5份，精密吸取10μL進(jìn)樣檢測，記錄山柰酚的峰面積，計(jì)算RSD為1.21%（n=5），表明實(shí)驗(yàn)方法的重復(fù)性較好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下，于0、4、8、12、16 h分別記錄山柰酚峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值為1.01%，表明供試液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取已知含量的藥材適量，分別精密加入一定量的山柰酚對照品，按供試品制備與測定方法，在上述色譜條件下，平行做5組，結(jié)果測得其平均回收率為101.04%，RSD為1.02%。

2.3.9 樣品測定 依上述方法，測定9批松針?biāo)幉闹猩借头雍?。結(jié)果見表1。色譜圖如圖3所示，圖中1為山柰酚。

3 討論

3.1 樣品處理?xiàng)l件的確定 本研究考察了甲醇-10%鹽酸（4∶1）、甲醇-20%鹽酸（4∶1）和甲醇-30%鹽酸（4∶1）3種水解溶劑。結(jié)果表明以甲醇-20%鹽酸（4∶1）混合液作為水解溶劑時(shí)所得樣品含量最高，故確定采用甲醇-20%鹽酸（4∶1）混合液為水解溶劑。又以甲醇-20%鹽酸（4∶1）混合液為溶劑，比較了回流和超聲方法對提取率的影響，結(jié)果回流提取率明顯高于超聲。同時(shí)還進(jìn)一步比較了不同提取時(shí)間和次數(shù)對提取效果的影響，最終確定提取2次，每次1.5 h基本能夠提取完全。

3.2 薄層條件的確定 通過比較多種展開系統(tǒng)苯-乙酸乙酯-乙酸、環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸、甲苯-乙酸乙酯-甲酸、環(huán)己烷-三氯甲烷-丙酮等，結(jié)果表明環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（4∶5∶1）作為展開劑斑點(diǎn)清晰、分離度好。考察了三種不同品牌的薄層板：硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）、硅膠G薄層板（青島美高集團(tuán)有限公司）、自制硅膠G薄層板，均可對松針中山柰酚成分進(jìn)行定性鑒別。按照試驗(yàn)所得薄層色譜條件，考察本品在溫度15～29℃、相對濕度為40%～70%展開時(shí)，對薄層色譜結(jié)果的影響。結(jié)果表明，在上述溫度、相對濕度范圍內(nèi)對該薄層色譜結(jié)果無明顯影響，9批不同產(chǎn)地的松針樣品均可檢出山柰酚，斑點(diǎn)清晰且方法簡便、快速、可行，此方法可用作松針?biāo)幉牡亩ㄐ澡b別。

3.3 色譜條件優(yōu)化 考察了2種色譜柱，InertSustainC18（250mm×4.6mm， 5μm）和Phenomenex Gemini-NX C18（250mm×4.6mm， 5μm）色譜柱，結(jié)果顯示，后者所得山柰酚峰和雜質(zhì)峰分離效果較差，峰形展寬，而前者分離效果較好，故選擇InertSustainC18（250mm×4.6mm， 5μm）色譜柱。對不同流動相系統(tǒng)（甲醇-水、乙腈-1%冰醋酸、乙腈-0.3%磷酸、甲醇-0.3%磷酸水溶液），結(jié)果顯示以乙腈-0.3%磷酸水溶液（30∶70）的分離效果較好，所得峰形及峰純度最好?？疾炝瞬煌魉伲?.8、0.9、1.0mL/min）、不同柱溫（25、30、40℃），確定最佳流速為1mL/min，柱溫40℃。在上述條件下測得山柰酚相對標(biāo)準(zhǔn)偏差、分離度均符合定量測定要求。

本實(shí)驗(yàn)首次比較全面建立了云南松松針?biāo)幉乃?、灰分、浸出物檢查，薄層色譜鑒別以及藥材含量測定方法，且方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，為松針?biāo)幉牡馁|(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2018-03-09 編輯：陶希睿）