基于SSR標記的小麥族St、H、Y基因組六倍體 物種遺傳變異及種間親緣關(guān)系研究

陳仕勇,馬嘯,張新全*,陳智華,周青平

(1.西南民族大學生命科學與技術(shù)學院，四川 成都 610041；2.四川農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學系，四川 成都 611130； 3.西南民族大學青藏高原研究院，四川 成都 610041)

小麥族(Triticeae)是禾本科植物中十分重要的一個類群，它不僅包含小麥(Triticumaestivum)、大麥(Hordeumvulgare)等重要糧食作物，還包含冰草屬(Agropyron)、偃麥草屬(Elytrigia)和披堿草屬(Elymus)等許多優(yōu)良牧草資源。小麥族物種的分類學與系統(tǒng)學研究是現(xiàn)代麥類作物與牧草育種中利用異種、屬種質(zhì)資源的必要理論基礎(chǔ)之一[1-2]。其中小麥族含有St、H、Y基因組的物種是其中最大的一個類群。該類群主要包括披堿草屬和鵝觀草屬(Roegneria)等多年生屬，它們不僅是重要的牧草資源，如老芒麥(Elymussibiricus)和垂穗披堿草(Elymusnutans)等，還擁有豐富的抗病等抗逆性基因資源，是牧草和麥類作物遺傳改良的重要基因庫[3-6]。該類群由于物種較多，分類較為復雜，種屬界限等系統(tǒng)關(guān)系存在較多爭議，如披堿草屬、鵝觀草屬這兩個屬的種屬關(guān)系一直是小麥族種質(zhì)資源研究利用中的難點，所以開展小麥族St、H、Y基因組物種的種屬間系統(tǒng)關(guān)系研究對該類群種質(zhì)資源的保護利用等具有重要意義。

小麥族St、H基因組分別來源于擬鵝觀草屬(Pseudoroegneria)和大麥屬(Hordeum)，但Y基因組來源未知。該類群物種大多為異源多倍體物種，主要包括四倍體(2n=4x=28)StH、StY組成物種和六倍體(2n=6x=42)StHY、StStY、StStH、StHH組成物種。目前的研究主要集中在StH和StY四倍體物種上，相關(guān)研究揭示了StH和StY物種的遺傳變異和分化、種間親緣關(guān)系[7-9]，并探討了其分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因組的進化等[10-12]。然而，關(guān)于StHY、StStY、StStH和StHH組成的六倍體物種的系統(tǒng)發(fā)育與進化方面的系統(tǒng)研究還較少，其種屬界限仍存在爭議，種間親緣關(guān)系等有待進一步研究。

該類群六倍體物種主要分屬于披堿草屬和鵝觀草屬，全球約30種，主要分布于中亞和東亞地區(qū)；其中我國分布約20種，主要分布于我國青藏高原及內(nèi)蒙古等地區(qū)。經(jīng)典分類學對該類群的分類處理為每個穗軸節(jié)上含有兩個或多個小穗的屬于披堿草屬，每個穗軸節(jié)只含一個小穗的則屬于鵝觀草屬[13]。然而按照細胞學基因組組成劃分的處理，含有St和H基因組的物種如StHH和StStH屬于披堿草屬，含有St和Y基因組的物種如StStY屬于鵝觀草屬，而StHY基因組物種則屬于曲穗草屬(Campeiostachys)[1,14]。后者最大的變動是將具有StHY基因組的物種分別從披堿草屬和鵝觀草屬中劃分出來歸入曲穗草屬。但基于基因組組成的劃分結(jié)果是否能夠反映該類群物種的親緣關(guān)系，其與經(jīng)典分類學中形態(tài)學的對應(yīng)關(guān)系及分類界限等問題都有待進一步研究。目前，小麥族St、H、Y六倍體物種的研究多集中在StHY物種之間以及某個重要物種如垂穗披堿草等種質(zhì)資源的遺傳多樣性評價[15-16]。如基于SSR等分子標記[17-18]、胞質(zhì)基因序列[19]及細胞遺傳學[20]等研究結(jié)果主要揭示了披堿草屬StHY物種之間遺傳變異和分化，而系統(tǒng)地對小麥族St、H、Y六倍體的不同基因組物種種間關(guān)系的研究還較少。本研究選用SSR對該類群六倍體不同基因組組成物種的遺傳親緣關(guān)系以及形態(tài)學特征等進行系統(tǒng)分析，擬在廣泛系統(tǒng)收集的小麥族St、H、Y基因組六倍體物種種質(zhì)的基礎(chǔ)上，采用SSR分子標記對其遺傳變異及種間親緣關(guān)系進行分析，以期為該類群物種的遺傳多樣性、種屬關(guān)系及系統(tǒng)演化等研究提供重要的參考，特別是對小麥族披堿草屬、鵝觀草屬、曲穗草屬等屬、種間分類界限及系統(tǒng)關(guān)系的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究廣泛系統(tǒng)地收集了小麥族St、H、Y基因組六倍體的不同基因組組成的物種25個，共計46份種質(zhì)資源。其中包括StHY基因型物種14個，StHH基因型物種2個，StStH基因型物種3個，StStY基因型物種2個，未知基因組六倍體物種4個，不同物種的地理來源等信息詳見表1。其中PI、W6編號材料由美國國家種質(zhì)資源庫提供，G編號材料由中國農(nóng)業(yè)部牧草種質(zhì)資源庫提供，J編號材料(E.humidus)由日本岡山大學植物遺傳資源中心提供，H編號材料由瑞典農(nóng)業(yè)大學Salomon博士提供，Y編號材料由四川農(nóng)業(yè)大學小麥研究所提供，其他材料為本課題采集材料。大部分供試材料種植于四川阿壩州紅原的西南民族大學青藏基地牧草種質(zhì)資源圃。

1.2 試驗方法

每份材料選取10株左右單株并取幼嫩葉片混合后，采用植物DNA快速提取試劑盒DP305(北京天根)提取DNA，采用NanoVue超微量分光光度計檢測其濃度及純度。

1.3 PCR擴增及電泳分析

本研究SSR分析的引物篩選自小麥族近緣種屬中高通用性SSR和EST-SSR引物共27對，包括20對EST-SSR，分別為披堿草屬10對(Elw)、擬鵝觀草屬4對(B_)、賴草屬(Leymus)5對(Ltc)、小麥1對(Xcwem)；7對SSR，分別為披堿草屬1對(EAGA)、大麥4對(HVM)、小麥2對(WMS)，具體引物信息及PCR流程參考陳仕勇等[21]的方法進行。PCR選擴產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對試驗結(jié)果中各標記目標擴增區(qū)域的條帶進行統(tǒng)計分析，將PCR擴增產(chǎn)物每個條帶視為1個位點，按條帶有或無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0，構(gòu)建相關(guān)二元數(shù)據(jù)矩陣。分別統(tǒng)計每對引物總擴增條帶數(shù)(total number of bands, TNB)，多態(tài)性擴增條帶數(shù)(number of polymorphic bands, NPB)，多態(tài)性條帶百分比(percentage of polymorphic bands, PPB)，多態(tài)性信息含量指數(shù)(polymorphic information content, PIC)[22]。采用NTSYS-pc 2.11x 軟件分析材料間的Dice遺傳相似系數(shù)(genetic similarity coefficients, GS)[23]，同時基于Dice遺傳相似系數(shù)進行非加權(quán)成對算術(shù)平均法(unweighted pair group method with arithmetic average, UPGMA)聚類分析和主成分分析(principal component analysis, PCA)[24]，聚類樹形圖節(jié)點分支的可靠性采用FreeTree軟件進行Bootstrap分析，設(shè)定重復抽樣次數(shù)為1000次[25]。供試材料的遺傳結(jié)構(gòu)采用Structure 2.3進行分析[26]。

表1 材料列表Table 1 The materials used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR遺傳多樣性分析

本研究中選用高通用性的27對SSR引物在46份供試材料中共擴增出條帶(TNB)229條，其中多態(tài)性條帶(NPB)213條，多態(tài)性條帶比率(PPB)為93.01%。每對引物擴增條帶變化數(shù)為3～15條，多態(tài)性條帶為1～15條，平均每對引物擴增條帶8.48條，多態(tài)性條帶數(shù)為7.93條；PIC值變化為0.126(HVM40)～0.462(Ltc1305)，平均值為0.305，其中引物Elw4419s261、EAGA22a和Elw3264s184等在本研究表現(xiàn)出了較高的擴增效率(表2，圖1)。本研究中的高通用性SSR標記在供試物種的遺傳關(guān)系分析中表現(xiàn)出了較高的多態(tài)性和擴增效率。

表2 SSR擴增情況Table 2 Performance of SSR markers in the study

圖1 SSR引物Elw2202s122的擴增電泳圖譜Fig.1 The electrophoretogram amplificaed by SSR marker Elw2202s122

2.2 遺傳相似系數(shù)分析

基于SSR標記數(shù)據(jù)，供試材料間的遺傳相似系數(shù)(GS)變異范圍為0.505～0.981，平均值為0.675，其中最大值為E.tangtorum(G05275)和E.cylindricus(HY-4)之間的0.981，最小值為E.schrenkianus(PI639756)和E.repens(PI565006)之間的0.505。其中StHY基因組物種間的GS值的變異范圍為0.544～0.981，平均值為0.722；StStY基因組材料間的GS值的變異范圍為0.509～0.899，平均值為0.700；StStH基因組材料間GS值的變異范圍為0.530～0.843，平均值為0.663；StHH基因組材料間GS值的變異范圍為0.550～0.827，平均值為0.677。SSR標記結(jié)果揭示了供試的六倍體物種之間存在豐富的遺傳變異和不同程度的種間分化。

2.3 聚類及主成分分析

基于SSR數(shù)據(jù)的UPGMA聚類結(jié)果將供試材料分為六大類(圖2)。第Ⅰ類包括StHY基因組的物種，其進一步被分成StHY-A和StHY-B兩種不同類型，分別為E.dahuricus和E.nutans類型。其中StHY-A類包括E.dahuricus復合群體的物種，包括E.dahuricus、E.excelsus、E.cylindricus、E.dahuricusvar.violeus、E.villifer、E.tangutorum、E.purpuraristatus和E.drobovii等，表現(xiàn)出直立的穗部形態(tài)特征，且每穗軸節(jié)上有2到多個小穗。StHY-B類包括E.nutans、E.submuticus、E.breviaristatus、E.atratus和R.aristiglumis等，表現(xiàn)出下垂的穗部形態(tài)特征，且除R.aristiglumis外其余材料的每穗軸節(jié)上僅有1枚小穗。第Ⅱ類主要包括具有StHH基因組的3份材料，如E.patagonicus、E.scabriglumis等和1份StStY基因組物種，但是后者具有較低的分支支持率。第Ⅲ類僅包括E.transhyrcanus物種1份材料，表現(xiàn)一定的特異性。第Ⅳ類包括了具有StHY和StStH基因組的物種，如E.repens和StHY基因組的StHY-C類型物種，包括R.kamoji類型的鵝觀草屬六倍體物種，如R.kamoji、E.tsukushiensis和E.humidus等，其穗狀花序下垂且每穗軸節(jié)上為單小穗。第Ⅴ類主要包括StHY和StStY基因組類型物種的5份材料，如E.schrenkianus、E.tschimganicus等。第Ⅵ類則包括2份StHH、StStH基因組類型的材料。主成分分析與聚類分析結(jié)果基本保持一致，主成分分析二維散點圖(圖3)更直觀地反映了供試材料間的親緣關(guān)系，其中前3個主成分分別能解釋總變異的68.46%，5.95%和3.39%。

圖2 基于SSR數(shù)據(jù)的六倍體物種UPGMA聚類Fig.2 Dendrogram of hexaploid species based on SSR data using UPGMA method

2.4 遺傳結(jié)構(gòu)分析

圖3 基于SSR數(shù)據(jù)的六倍體物種的主成分分析圖Fig.3 The PCA of hexaploid species based on SSR data

根據(jù)遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，供試材料被劃分為4個類群(K=4，圖4)。其中第Ⅰ類(黃色)包括了所有的StHY-A類的物種。第Ⅱ類(紫色)包括了所有的StHY-B類物種。第Ⅲ類(紅色)則包括了StHY-C類物種。第Ⅳ類(藍色)包括的類型較多，包括StStY、StStH、StHH以及具有StHY基因組組成的E.schrenkianus和E.himalayanus。遺傳結(jié)構(gòu)分析與聚類及主成分分析結(jié)構(gòu)也基本保持一致，遺傳結(jié)構(gòu)分析進一步揭示了供試物種間的遺傳親緣關(guān)系及種間分化。

3 討論

3.1 國產(chǎn)披堿草六倍體基因組組成分析

本研究SSR分析結(jié)果均表明E.breviaristatus、E.submuticus、E.atratus3個物種與E.nutans聚為一類且具有較高的分支支持率，親緣關(guān)系非常近，這與其形態(tài)特征相吻合，均為下垂穗狀花序且每個穗軸節(jié)含有多個小穗。從基因組組成上分析，E.breviaristatus、E.submuticus、E.atratus與E.nutans應(yīng)該具有相同的StHY的基因組組成，并形成StHY-B分化類型。這與Dong等[27]基于nrITS、matK、trnH-psbA等序列分析的結(jié)果保持一致。另一直穗物種E.dahuricusvar.violeus在聚類、主成分及遺傳結(jié)構(gòu)分析中均聚在E.dahuricus復合群體中，與E.dahuricus、E.excelsus、E.cylindricus等物種表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，其基因組組成也應(yīng)為StHY，屬于StHY-A直穗分化類型，這與E.dahuricus復合群體材料基于熒光原位雜交FISH(fluorescence in situ hybridization)和基因組原位雜交GISH(genomic in situ hybridization)技術(shù)的分析結(jié)果保持一致[28-29]，這也揭示了國產(chǎn)披堿草屬六倍體物種均為StHY基因組組成的物種。

圖4 供試六倍體物種種質(zhì)資源的遺傳結(jié)構(gòu)Fig.4 The genetic structure analysis of the hexaploid species

3.2 披堿草屬和鵝觀草屬六倍體物種種間關(guān)系

本研究對小麥族St、H、Y不同基因型組成的六倍體物種進行分析，遺傳相似系數(shù)及聚類分析等結(jié)果表明其具有相同或相似的基因組組成，物種之間親緣關(guān)系較近，不同屬但具有相同基因組組成物種能夠聚在一起。例如具有StHY基因型組成的物種R.aristiglumis原屬于鵝觀草屬且每穗軸為單小穗，但與披堿草屬StHY物種E.nutans和E.submuticus表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系。種間關(guān)系的研究結(jié)果也給傳統(tǒng)的以形態(tài)學為標準的披堿草屬、鵝觀草屬等的種屬間界限提出了異議[13]，且作者在野外資源采集過程中也會發(fā)現(xiàn)一些屬于鵝觀草屬的物種每穗軸節(jié)上含有2個小穗的基因型出現(xiàn)。本研究結(jié)果也揭示了基于基因組組成的分類體系可能更能反映其遺傳親緣關(guān)系和系統(tǒng)分類地位，但是仍有少部分具有相同基因組組成的物種卻表現(xiàn)出較遠的親緣關(guān)系，聚類不明顯，如本研究中來自巴基斯坦的E.himalayanus、來自伊朗的E.transhyrcanus等材料。這可能主要由于St、H基因組的不同供體物種參與了披堿草屬、鵝觀草屬異源多倍化的進程，具有多個起源，且其基因組分化較明顯[12,27]。此外，不同的地理來源和生境也可能造成這種大的種間遺傳分化以及形成不同的地理分化類型。在披堿草屬物種的種內(nèi)就存在明顯的地理分化，如分子標記及細胞學證據(jù)均表明垂穗披堿草(E.nutans)存在廣泛的遺傳變異和地理分化，來自青藏高原與新疆的材料間的分化非常明顯，青藏高原地區(qū)也存在不同的分化類型[15,29]。

3.3 StHY基因組物種的遺傳分化

供試材料中具有StHY基因組的物種表現(xiàn)出了3類明顯的分化類型，即E.dahuricus(StHY-A)、E.nutans(StHY-B)、R.kamoji(StHY-C)類型，同時其分化類型同形態(tài)學特征相吻合，這也與已經(jīng)報道的關(guān)于披堿草屬StHY物種分化情況相一致。李永祥等[17]采用分子標記揭示了國產(chǎn)披堿草屬六倍體物種中直穗類型與垂穗類型之間的分化。Dou等[20]采用原位雜交技術(shù)分析了1個四倍體E.sibiricus及5個六倍體物種E.nutans、E.barystachyus、E.xiningensis、E.excelsus、E.dahuricus的分子核型變異，結(jié)果將其劃分為E.sibiricus類、E.nutans類及E.dahuricus類。Sasanuma等[18]基于擴增片段長度多態(tài)性標記(amplified fragment length polymorphism，AFLP)結(jié)果揭示了來自日本的E.tsukushiensis、E.humidus和東亞的E.dahuricus3個StHY基因組物種的分化，形態(tài)上相似的E.tsukushiensis和E.humidus之間的分化程度較低并具有較近的親緣關(guān)系，它們與E.dahuricus之間的分化程度較高，親緣關(guān)系也較遠。本研究在系統(tǒng)分析StHY基因組物種遺傳親緣關(guān)系的基礎(chǔ)上，提出了關(guān)于StHY基因組物種的3種分化類型，但具有StHY基因組組成的E.schrenkianus物種也表現(xiàn)出了與這3種分化類型的差異，且更偏向與StStY基因組物種較近的親緣關(guān)系。這也可能與本研究采用的標記數(shù)目及地理來源等有關(guān)，所以關(guān)于其分類地位及系統(tǒng)關(guān)系有待進一步分析。

3.4 E. dahuricus復合群體分類地位

在披堿草屬六倍體物種中，直穗類型物種E.dahuricus、E.tangutorum、E.excelsus、E.cylindricus、E.purpuriaristatus等物種具有非常相似的形態(tài)學特征和較近的親緣關(guān)系，即披堿草復合類群(E.dahuricscomplex)，其復合類群物種間的種間關(guān)系和界限也一直是研究的焦點。劃為曲穗草屬后，Baum等[14]將E.dahuricus復合群體中的其他幾個種處理為C.dahuricus的幾個變種，即C.dahuricusvar.excelsus、C.dahuricusvar.tangutorum、C.dahuricusvar.cylindrica等。Agafonov 等[30]利用蛋白質(zhì)電泳、DNA分子標記及種間雜交染色體配對分析也揭示了E.dahuricus復合群體的分化，同時表明了它們是具有廣泛地理分布和變異的多態(tài)性物種，并建議將其降級為種以下的分類群。在本研究結(jié)果中E.dahuricus復合群體幾個物種明顯聚在一起，表現(xiàn)出了較近的親緣關(guān)系，甚至個別物種的種間界限不是很明顯，所以也支持將其分類等級降為變種處理。

4 結(jié)論

本研究采用SSR分子標記分析了小麥族St、H、Y不同基因組組成的六倍體物種，研究結(jié)果揭示了供試的不同基因組組成的六倍體物種之間具有豐富的遺傳多樣性和明顯的種間分化，其中StHY物種明顯分化成3種類型；相同或相似基因組組成的物種間表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系，本研究結(jié)果支持基于基因組組成的分類體系對該類群物種分類地位的劃分。