自噬相關(guān)蛋白ATG16L1在腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)中的作用*

王嘉正 沈玉潔 張 琮 周明霞 陳穎偉,2,3&

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科1(200092) 上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所2 上海市小兒消化與營(yíng)養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3

背景：自噬相關(guān)基因ATG16L1單核苷酸多態(tài)性(SNP)與克羅恩病(CD)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。目的：探討ATG16L1在腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)中的作用。方法：利用人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株Caco-2構(gòu)建體外腸上皮細(xì)胞模型，予ATG16L1 siRNA干預(yù)，并以白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)誘導(dǎo)炎癥因子表達(dá)。采用real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證ATG16L1 siRNA轉(zhuǎn)染的有效性，real-time PCR和ELISA法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞IL-6、IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)表達(dá)。結(jié)果：研究使用的siRNA能有效抑制ATG16L1表達(dá)。IL-1β可誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞IL-6、IL-8、MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，沉默ATG16L1可使IL-1β誘導(dǎo)的上述炎癥因子表達(dá)進(jìn)一步增高(P<0.05)。結(jié)論：在腸上皮細(xì)胞中，ATG16L1可負(fù)性調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)，在維持腸黏膜免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一類主要累及腸道的慢性非特異性炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)。目前研究認(rèn)為IBD是在攜帶易感基因的遺傳背景下，由腸道微生物觸發(fā)宿主腸道免疫功能紊亂所致[1]。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)基因ATG16L1(autophagy-related 16-like 1)單核苷酸多態(tài)性(SNP)與CD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[2-4]，該結(jié)果近年已在中國(guó)人群中得到證實(shí)[5]。ATG16L1基因最常見的SNP位點(diǎn)是rs2241880，該位點(diǎn)錯(cuò)義突變導(dǎo)致ATG16L1蛋白第300位蘇氨酸(threonine)為丙氨酸(alanine)所取代，以T300A表示。T300A可促進(jìn)caspase-3和caspase-7介導(dǎo)的ATG16L1蛋白降解，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATG16L1表達(dá)降低[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)ATG16L1缺陷可增強(qiáng)細(xì)菌代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)的單核/巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)[8-9]，但ATG16L1是否能調(diào)控腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究以白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)作用于腸上皮細(xì)胞模擬腸道炎癥狀態(tài)，并以RNA干擾技術(shù)沉默ATG16L1，旨在探討ATG16L1在腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)中的作用，以期為闡明CD發(fā)病機(jī)制提供新思路。

材料與方法

一、細(xì)胞株和主要試劑

人結(jié)腸腺癌細(xì)胞株Caco-2購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，由上海市兒科醫(yī)學(xué) 研究所保存。Transwell小室、DMEM培養(yǎng)基(Corning Incorporated)；胎牛血清、非必需氨基酸、青/鏈霉素、Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基、TRIzol試劑(Thermo Fisher Scientific)；HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑(QIAGEN)；IL-1β(PeproTech, Inc)；PrimeScriptTMRT Master Mix(Takara Bio Inc.)；HieffTMqPCR SYBR Green Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司)； ATG16L1抗體(Abcam plc.)；IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)ELISA試劑盒(上海達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)。ATG16L1 siRNA、陰性對(duì)照(negative control, NC)siRNA由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成，ATG16L1 siRNA靶序列：5’-GGA TCC AGT TGC AAT GAT A-3’。

二、方法

1. 體外腸上皮細(xì)胞模型建立：將Caco-2細(xì)胞以3×104/cm2的密度接種于Transwell小室中，加入含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，隔日換液。細(xì)胞培養(yǎng)10～14 d后，通過監(jiān)測(cè)跨上皮細(xì)胞電阻(transepithelial electrical resistance, TEER)判斷細(xì)胞分化程度。測(cè)定TEER時(shí)以HBSS替換Transwell小室內(nèi)、外培養(yǎng)基，于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置30 min。Transwell小室膜具有一定電阻，因此應(yīng)分別測(cè)定空白小室和接種細(xì)胞小室的電阻。TEER=(接種細(xì)胞小室電阻-空白小室電阻)×小室底面積，單位為Ωcm2。TEER≥ 400 Ωcm2可認(rèn)為Caco-2細(xì)胞分化成熟，體外腸上皮細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

2. 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)基更換為Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基。在1.5 mL離心管中依次加入Opti-MEMTM減血清培養(yǎng)基、NC siRNA/ATG16L1 siRNA和HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑，混勻靜置15 min后加入培養(yǎng)基中。6 h后將減血清培養(yǎng)基更換為含血清DMEM完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后檢測(cè)目的基因mRNA表達(dá)，48 h后檢測(cè)目的蛋白表達(dá)。

3. Real-time PCR：分化成熟的Caco-2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NC siRNA和ATG16L1 siRNA 24 h后，每組進(jìn)一步分為兩組，予10 ng/mL IL-1β處理3 h或不予處理，即分為NC siRNA組、NC siRNA+IL-1β組、ATG16L1 siRNA組和ATG16L1+IL-1β組四組。 TRIzol試劑提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，循環(huán)40次。2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

表1 Real-time PCR目的基因引物序列

4. 蛋白質(zhì)印跡法：分化成熟的Caco-2細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NC siRNA和ATG16L1 siRNA 48 h后，加入100 μL含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液提取總蛋白。取20 μg總蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，室溫封閉1 h，加入ATG16L1抗體(1∶5 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h；ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

5. ELISA：實(shí)驗(yàn)分組同real-time PCR，siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)間為48 h，IL-1β處理時(shí)間為24 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基與稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品加入反應(yīng)孔(100 μl/孔)，隨后加入一抗(50 μl/孔)，37 ℃孵育2 h；洗滌3次，印干；加入二抗(100 μl/孔)，37 ℃孵育1 h；洗滌3次，印干；加入底物(100 μl/孔)，37 ℃避光孵育5～10 min；加入終止液(100 μl/孔)。使用酶標(biāo)儀讀取波長(zhǎng)450 nm處吸光度(A)值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對(duì)應(yīng)的A值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品IL-6、IL-8、MCP-1濃度。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、ATG16L1 siRNA有效性驗(yàn)證

與NC siRNA組相比，ATG16L1 siRNA組Caco-2細(xì)胞ATG16L1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低， 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，證明研究使用的siRNA能有效抑制ATG16L1表達(dá)(圖1)。

圖1Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染ATG16L1siRNA后ATG16L1mRNA和蛋白表達(dá)

二、ATG16L1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)的影響

與NC siRNA組相比，NC siRNA+IL-1β組Caco-2細(xì)胞IL-6、IL-8、MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明IL-1β可誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)；與NC siRNA+IL-1β組相比，ATG16L1 siRNA+IL-1β組上述炎癥因子mRNA和蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高(P<0.05)，表明ATG16L1可抑制IL-1β誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)(圖2)。

圖2 沉默ATG16L1對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響

討 論

自噬是細(xì)胞的一種代謝過程。在細(xì)胞內(nèi)、外信號(hào)的刺激下，細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生雙層膜結(jié)構(gòu)，將胞內(nèi)大分子蛋白或細(xì)胞器包裹形成自噬體，隨后自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，并對(duì)內(nèi)容物進(jìn)行分解，為細(xì)胞提供能量來源和物質(zhì)合成的原料，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用[10]。隨著自噬相關(guān)基因ATG16L1被發(fā)現(xiàn)是CD易感基因，自噬在CD發(fā)生中的作用開始受到關(guān)注，為CD發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的方向。

ATG16L1缺陷的細(xì)胞，自噬體形成和蛋白降解受到嚴(yán)重影響。Saitoh等[8]的研究以脂多糖刺激ATG16L1缺陷的巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-18表達(dá)顯著增加。其后Plantinga等[9]使用NOD2配體胞壁酰二肽刺激攜帶ATG16L1突變(T300A)CD患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，亦發(fā)現(xiàn)IL-1β、IL-6分泌顯著增加。上述結(jié)果表明在單核/巨噬細(xì)胞中，ATG16L1發(fā)揮抑制炎癥因子表達(dá)和免疫炎癥反應(yīng)的作用，而ATG16L1缺陷引起的IL-1β分泌異?？赡苁菍?dǎo)致CD發(fā)生的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，在Caco-2體外腸上皮細(xì)胞模型中，以RNA干擾技術(shù)沉默ATG16L1可顯著上調(diào)IL-1β誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6、IL-8、MCP-1表達(dá)，證實(shí)ATG16L1在腸上皮細(xì)胞中亦發(fā)揮負(fù)性調(diào)控炎癥因子表達(dá)的作用。除調(diào)控炎癥因子表達(dá)外，ATG16L1在抗菌免疫方面也發(fā)揮重要作用。Cadwell等[11]發(fā)現(xiàn)ATG16L1缺陷Paneth細(xì)胞的顆粒胞吐途徑出現(xiàn)異常，表現(xiàn)為溶菌酶釋放減少，該現(xiàn)象在攜帶ATG16L1突變的CD患者腸道組織中得到證實(shí)，表現(xiàn)為顆粒排列紊亂、消失或胞質(zhì)內(nèi)溶酶體彌漫染色的Paneth細(xì)胞比例增加。此外，Conway等[12]發(fā)現(xiàn)ATG16L1對(duì)于腸上皮細(xì)胞清除沙門菌感染至關(guān)重要。

盡管ATG16L1對(duì)炎癥因子的調(diào)控作用已得到證實(shí)，但其內(nèi)在機(jī)制有待闡明。研究發(fā)現(xiàn)ATG16L1通過與ATG5和ATG12形成復(fù)合物，促進(jìn)ATG8/LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)與磷脂酰乙醇胺結(jié)合[13]，該過程對(duì)于形成完整的自噬體至關(guān)重要。ATG16L1表達(dá)減少將影響自噬體形成，進(jìn)而導(dǎo)致通過自噬降解的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)積聚。有研究發(fā)現(xiàn)敲除ATG16L1可引起p62蛋白表達(dá)增加[8,12]。p62是一種多功能蛋白，一方面其可與自噬效應(yīng)蛋白LC3結(jié)合，使p62-LC3陽(yáng)性小體通過自噬過程被降解[14]，另一方面還可參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。p62通過與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)結(jié)合，調(diào)節(jié)NF-κB抑制蛋白激酶(IKK)活性[15]。而IKK通過磷酸化NF-κB抑制蛋白(IκB)解除其對(duì)NF-κB的抑制作用，促進(jìn)NF-κB入核啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄[16]。研究發(fā)現(xiàn)IL-1β可激活NF-κB，腸上皮細(xì)胞中的炎癥因子如IL-6、IL-8、MCP-1等的表達(dá)受NF-κB調(diào)控[17-18]。由此推測(cè)，在ATG16L1基因突變(T300A)的遺傳背景下，腸上皮細(xì)胞自噬過程受抑，p62因降解受阻而在細(xì)胞內(nèi)積聚，促進(jìn)NF-κB激活，進(jìn)而增加其下游炎癥因子表達(dá)。

綜上所述，在腸上皮細(xì)胞中，ATG16L1可負(fù)性調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)，在維持腸黏膜免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，該過程可能是通過促進(jìn)p62降解、抑制NF-κB激活實(shí)現(xiàn)的。在ATG16L1基因多態(tài)性的遺傳背景下，自噬過程異常引起的炎癥因子分泌紊亂和抗菌免疫受損可能是CD發(fā)生的原因。通過改善腸上皮細(xì)胞的自噬狀態(tài)抑制炎癥因子表達(dá)有望成為治療CD的新方法。