• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR—221對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后炎性因子表達(dá)的影響

    2018-09-17 02:51:41何寶明柏瑩李艷琴
    關(guān)鍵詞:物組報(bào)告基因熒光素酶

    何寶明 柏瑩 李艷琴

    [摘要] 目的 探討microRNA-221(miR-221)對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后炎癥因子水平的影響。 方法 用qRT-PCR檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染后巨噬細(xì)胞中miR-221的表達(dá);用miR-221模擬物和miR-221抑制物轉(zhuǎn)染結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞,采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法和Griess法分別檢測(cè)炎癥因子表達(dá)和NO分泌;雙熒光素酶報(bào)告基因、qRT-PCR和Western blot法檢測(cè)miR-221和Rho相關(guān)蛋白激酶1(ROCK1)的靶向關(guān)系。 結(jié)果 miR-221在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞中低表達(dá);miR-221模擬物上調(diào)巨噬細(xì)胞miR-221的表達(dá)水平,抑制巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6和NO的分泌;miR-221抑制物下調(diào)巨噬細(xì)胞miR-221的表達(dá)水平,促進(jìn)巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的分泌;miR-221可作用于ROCK1的3′UTR,并抑制其表達(dá)(P < 0.05)。 結(jié)論 miR-221通過(guò)靶向抑制ROCK1的表達(dá)抑制結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后的炎癥因子的表達(dá)。

    [關(guān)鍵詞] 結(jié)核分枝桿菌;單核巨噬細(xì)胞;MicroRNA-221;Rho相關(guān)蛋白激酶1;炎癥因子

    [中圖分類號(hào)] R521 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210(2018)08(c)-0014-05

    [Abstract] Objective To explore the effects of miR-221 on the inflammatory factor secretion from macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection. Methods The expression of miR-221 in macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection was detected by real-time quantitative PCR (qRT-PCR). Macrophages were transiently transfected with miR-221 mimic or miR-221 inhibitor. The expression of macrophage inflammatory factor and secretion of NO were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and Griess method, respectively. The relationship of miR-221 and Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1 (ROCK1) was analyzed by dual-luciferase reporter gene assay, qRT-PCR and Western blot. Results Down-regulated miR-221 was observed in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis. The expression of miR-221 in macrophages was up-regulated by miR-221 mimics, but down-regulated by miR-221 inhibitors. The secretions of TNF-α, IL-1β, IL-6 and NO were significantly accelerated in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis, and increased in miR-221 up-regulated macrophages, but suppressed in miR-221 down-regulated macrophages. miR-221 directly binds to the 3′UTR of ROCK1, and negatively regulated its expression. Conclusion miR-221 can regulate the ROCK1 expression and inhibit the secration of inflammatory factors expression in macrophages after Mycobacterium tuberculosis infection.

    [Key words] Mycobacterium tuberculosis; Monocyte-derived macrophages; MicroRNA-221; Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase 1; Inflammatory factors

    肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染引發(fā)的一種慢性傳染性疾病[1]。巨噬細(xì)胞在肺結(jié)核的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[2]。結(jié)核分枝桿菌感染人體后,主要被巨噬細(xì)胞吞噬,隨后巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和分泌腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1β和IL-6等多種細(xì)胞因子介導(dǎo)機(jī)體的殺菌過(guò)程[3]。同時(shí),感染細(xì)菌的巨噬細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)的活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)升高,導(dǎo)致NOS的催化底物NO的的含量增加,此NO會(huì)作為強(qiáng)抗炎氧化劑促進(jìn)殺滅結(jié)核分枝桿菌[3]。因此,炎癥因子和NO在肺結(jié)核的疾病進(jìn)程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)miR-221能夠通過(guò)調(diào)節(jié)各類炎癥因子的表達(dá),在免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4-5]。據(jù)報(bào)道,microRNA-221(miR-221)在結(jié)核分枝桿菌感染的肺結(jié)核患者中表達(dá)降低[6-7]。本研究探討miR-221在巨噬細(xì)胞抗結(jié)核分枝桿菌感染的免疫調(diào)節(jié)中的作用。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑

    結(jié)核分枝桿菌強(qiáng)毒株H37Rv(美國(guó)ATCC公司);HEK293細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù));miR-221模擬物、抑制物(上海吉瑪生物制藥技術(shù)有限公司);酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海BlueGene公司)。

    1.2 細(xì)菌制備

    細(xì)菌初次傳代后培養(yǎng)6~7 d[8],收集菌液,制成單細(xì)菌懸液,再調(diào)整濃度至4×107個(gè)/mL。

    1.3 細(xì)胞分離和培養(yǎng)

    巨噬細(xì)胞分離自健康人的外周血(陜西省漢中市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科采集),方法如文獻(xiàn)[9]所述。取健康人的靜脈血,將血液離心得到單核細(xì)胞。洗滌去除血小板后,用含20%人血清白蛋白的RPMI 1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d換1次液,7~10 d后即可自然分化成巨噬細(xì)胞。

    1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的巨噬細(xì)胞,用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染miR-221模擬物、miR-221抑制物以及相應(yīng)的陰性對(duì)照,培養(yǎng)48 h。

    1.5 細(xì)菌感染巨噬細(xì)胞

    巨噬細(xì)胞與結(jié)核分枝桿菌的比例為1∶5,在含0.4%人血清白蛋白R(shí)PMI 1640培養(yǎng)基中混合[6],37℃孵育24、48、72 h后收集細(xì)胞。

    1.6 ELISA檢測(cè)

    收集細(xì)胞培養(yǎng)上清,用ELISA法分別檢測(cè)IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.7 Griess法

    收集培養(yǎng)上清液,加Griess試劑反應(yīng)10 min,檢測(cè)吸光度(OD550 nm)值,計(jì)算NO濃度,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因

    雙熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建:對(duì)ROCK1的3′UTR序列與miR-221相互作用進(jìn)行預(yù)測(cè),且對(duì)相互作用的靶點(diǎn)進(jìn)行序列突變(Mut ROCK1),并將突變序列插入到pGL3熒光素酶報(bào)告載體的XbaI/FseI位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增ROCK1包含miR-221假定結(jié)合位點(diǎn)的3'UTR cDNA,并將擴(kuò)增出的序列連接于pGL3雙熒光素酶報(bào)告基因載體上。將HEK293細(xì)胞種于24孔板中,將pGL3-ROCK1 3′-UTR與miR-221模擬物共轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞,在酶標(biāo)儀上檢測(cè)熒光素酶活性,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

    用TRIzol提取細(xì)胞總RNA。miR-221的檢測(cè):100 ng總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,以U6為內(nèi)參基因,用qRT-PCR試劑盒檢測(cè)miR-221表達(dá)水平。ROCK1的檢測(cè):2 μg RNA用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA,以β-actin為內(nèi)參基因,qRT-PCR試劑盒檢測(cè)ROCK1表達(dá)水平。用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)量。

    1.10 Western blot

    細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解后,用BCA法測(cè)蛋白濃度,等量蛋白樣本上樣,經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜,50 g/L脫脂奶粉封閉2 h后,加兔抗人ROCK1抗體,4℃孵育過(guò)夜;用TBST洗膜后,加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG,室溫孵育1 h,洗膜后,ECL化學(xué)發(fā)光顯色,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 結(jié)核分枝桿菌感染降低巨噬細(xì)胞miR-221的表達(dá)

    在結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞不同時(shí)間后,miR-221的表達(dá)水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見(jiàn)圖1。

    2.2 miR-221模擬物和miR-221抑制物改變巨噬細(xì)胞miR-221的表達(dá)水平

    將miR-221模擬物或miR-221抑制物轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞中,結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-221模擬物組的miR-211表達(dá)高于模擬物對(duì)照組,同時(shí)miR-221抑制物組的miR-211表達(dá)低于抑制物對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見(jiàn)圖2。

    2.3 miR-221抑制結(jié)核分枝桿菌感染后巨噬細(xì)胞炎癥因子的分泌

    感染組、模擬物對(duì)照組、抑制物對(duì)照組巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1、IL-6的表達(dá)高于對(duì)照組,miR-221模擬物組的TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)低于模擬物對(duì)照組,miR-221抑制物組的TNF-α、IL-1、IL-6表達(dá)高于抑制物對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見(jiàn)圖3。

    2.4 miR-221抑制結(jié)核分枝桿菌感染后巨噬細(xì)胞NO的釋放

    感染組、模擬物對(duì)照組、抑制物對(duì)照組的NO釋放量高于對(duì)照組,miR-221模擬物組的NO量高于模擬物對(duì)照組,miR-221抑制物組的NO量低于抑制物對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見(jiàn)圖4。

    2.5 miR-221對(duì)ROCK1的調(diào)控作用

    用靶基因預(yù)測(cè)軟件(TargetScan)發(fā)現(xiàn),在多種炎癥疾病中起重要作用的分子ROCK1是miR-221的一個(gè)靶基因(圖5A)。雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)miR-221,靶基因ROCK1 3′UTR區(qū)活性明顯受到抑制(P < 0.05,圖5B)。檢測(cè)miR-221對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染細(xì)胞中ROCK1表達(dá)的影響,感染組、模擬物對(duì)照組、抑制物對(duì)照組中ROCK1 mRNA和蛋白的表達(dá)高于對(duì)照組,miR-221模擬物組中ROCK1 mRNA和蛋白的表達(dá)低于模擬物對(duì)照組,miR-221抑制物組中ROCK1 mRNA和蛋白的表達(dá)高于抑制物對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05,圖5C~D)。

    3 討論

    巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌感染的主要靶細(xì)胞和宿主細(xì)胞,該細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌引起的免疫反應(yīng)中起重要作用[10]。機(jī)體感染結(jié)核桿菌后,巨噬細(xì)胞被激活,高表達(dá)NOS和L-精氨酸,并在四氫生物碟呤的存在下,催化產(chǎn)生非特異性的殺菌物質(zhì)NO,參與抗感染早期過(guò)程[11]。同時(shí)活化的巨噬細(xì)胞促進(jìn)TNF-α、IL-1、IL-6等細(xì)胞因子大量釋放,活化炎癥細(xì)胞,增強(qiáng)機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的殺傷功能。本實(shí)驗(yàn)中巨噬細(xì)胞用結(jié)核分枝桿菌感染后TNF-α、IL-1、IL-6釋放顯著增加。

    研究發(fā)現(xiàn),多種miRNA在肺結(jié)核患者血液中異常表達(dá)[12]。如miR-21[13]、miR-146a[14]和miR-144[2]等。據(jù)報(bào)道m(xù)iR-221可轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)因子的表達(dá)[4],可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)脂聯(lián)素受體1調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎性反應(yīng)[5]。Ni等[6]發(fā)現(xiàn)miR-221在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞中表達(dá)降低。本研究發(fā)現(xiàn),結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后,miR-221表達(dá)顯著降低,與現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[6]一致。此外,通過(guò)在巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-221模擬物及抑制物,提示miR-221模擬物降低炎性因子和NO分泌,miR-221抑制物促進(jìn)炎性因子和NO分泌,提示巨噬細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-221的表達(dá),抑制結(jié)核分枝桿菌的免疫清除。

    ROCK是炎癥疾病中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子,在脊髓損傷[15]、急性肺損傷[16]和心血管疾病[17-18]等多種炎癥疾病中起重要作用。ROCK以ROCK1和ROCK2兩種異構(gòu)體形式存在。ROCK1對(duì)炎癥細(xì)胞的黏附起重要的調(diào)節(jié)作用[19],且有實(shí)驗(yàn)證明ROCK1可激活巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[20]。本研究用生物信息學(xué)的方法預(yù)測(cè)出miR-221與ROCK1存在良好的堿基互補(bǔ)關(guān)系,并通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因、qRT-PCR和Western blot提示miR-221可靶向調(diào)控ROCK1的表達(dá)。

    綜上所述,miR-221在結(jié)核分枝桿菌感染的巨噬細(xì)胞中表達(dá)降低,miR-221負(fù)性調(diào)節(jié)結(jié)核分枝桿菌誘發(fā)的巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答,并可靶向抑制ROCK1 mRNA和蛋白的表達(dá),為研究巨噬細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的免疫機(jī)制提供理論依據(jù)。

    [參考文獻(xiàn)]

    [1] Mjid M,Cherif J,Ben Salah N,et al. Epidemiology of tuberculosis [J]. Rev Pneumol Clin,2015,71(2/3):67-72.

    [2] Liu HY. Down-regulation of miR-144 after Mycobacterium tuberculosis infection promotes inflammatory factor secretion from macrophages through the Tpl2/ERK pathway [J]. Cell Mol Biol(Noisy-le-grand),2016,62(2):87-93.

    [3] 程濤,伍偉玲,黃河.肺結(jié)核患者Th1/Th2/Treg/Th17免疫應(yīng)答的臨床研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2017,14(26):109-112.

    [4] Marques-Rocha JL,Samblas M,Milagro FI,et al. Noncoding RNAs,cytokines,and inflammation-related diseases [J]. FASEB J,2015,29(9):3595-3611.

    [5] Chen CF,Huang J,Li H,et al. MicroRNA-221 regulates endothelial nitric oxide production and inflammatory response by targeting adiponectin receptor 1 [J]. Gene,2015, 565(2):246-251.

    [6] Ni B,Rajaram MV,Lafuse WP,et al. Mycobacterium tuberculosis decreases human macrophage IFN-gamma responsiveness through miR-132 and miR-26a [J]. J Immunol,2014,193(9):4537-4547.

    [7] Barry SE,Chan B,Ellis M,et al. Identification of miR-93 as a suitable miR for normalizing miRNA in plasma of tuberculosis patients [J]. J Cell Mol Med,2015,19(7):1606-1613.

    [8] Lundqvist-Gustafsson H,Norrman S,Nilsson J,et al. Involvement of p38-mitogen-activated protein kinase in Staphylococcus aureus-induced neutrophil apoptosis [J]. J Leukoc Biol,2001,70(4):642-648.

    [9] Schlesinger LS. Macrophage phagocytosis of virulent but not attenuated strains of Mycobacterium tuberculosis is mediated by mannose receptors in addition to complement receptors [J]. J Immunol,1993,150(7):2920-2930.

    [10] Torres-Juarez F,Cardenas-Vargas A,Montoya-Rosales A,et al. LL-37 immunomodulatory activity during Mycobacterium tuberculosis infection in macrophages [J]. Infect Immun,2015,83(12):4495-4503.

    [11] Huang S,Robinson JB,Deguzman A,et al. Blockade of nuclear factor-kappaB signaling inhibits angiogenesis and tumorigenicity of human ovarian cancer cells by suppressing expression of vascular endothelial growth factor and interleukin 8 [J]. Cancer Res,2000,60(19):5334-5339.

    [12] Xu Z,Zhou A,Ni J,et al. Differential expression of miRNAs and their relation to active tuberculosis [J]. Tuberculosis,2015,95(4):395-403.

    猜你喜歡
    物組報(bào)告基因熒光素酶
    日本落葉松內(nèi)源GUS基因鑒定及其酶活性分析
    miR-365靶向調(diào)控USP22促進(jìn)大腸癌細(xì)胞組蛋白修飾和EMT
    miR-122對(duì)腦缺血再灌注損傷小鼠腦梗死體積及胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體通路的影響
    NNMT基因啟動(dòng)子雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建及其與SND1靶向關(guān)系的驗(yàn)證
    不同雙熒光素酶方法對(duì)檢測(cè)胃癌相關(guān)miRNAs靶向基因TIAM1的影響
    miRNA-19a在結(jié)腸癌中的表達(dá)及對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性的影響分析
    重組雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK-2-Intron構(gòu)建轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染細(xì)胞螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶表達(dá)
    miRNA-30a-5p過(guò)表達(dá)對(duì)腎癌細(xì)胞株786-0增殖、凋亡的影響
    啟動(dòng)子陷阱技術(shù)在植物啟動(dòng)子克隆研究中的應(yīng)用
    報(bào)告基因標(biāo)記在干細(xì)胞治療急性心肌梗死中的應(yīng)用進(jìn)展
    日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久久久久久久久久免费av| 国产又色又爽无遮挡免| 免费少妇av软件| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 赤兔流量卡办理| 免费看不卡的av| 欧美+日韩+精品| 九草在线视频观看| 精品酒店卫生间| 九草在线视频观看| 国产av精品麻豆| 国产成人精品无人区| 色94色欧美一区二区| 亚洲经典国产精华液单| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 亚洲av中文av极速乱| 男人操女人黄网站| 精品一区二区免费观看| 精品国产一区二区久久| 桃花免费在线播放| 亚洲内射少妇av| 在线观看国产h片| 中文字幕av电影在线播放| 毛片一级片免费看久久久久| 亚洲精品第二区| 在现免费观看毛片| 亚洲精品成人av观看孕妇| 飞空精品影院首页| 亚洲国产精品国产精品| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美激情 高清一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 在线天堂最新版资源| 交换朋友夫妻互换小说| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美bdsm另类| 亚洲精品色激情综合| 国产视频首页在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 亚洲av免费高清在线观看| 三级国产精品片| 久久精品国产亚洲av天美| 精品国产一区二区三区四区第35| 伦精品一区二区三区| 国产高清不卡午夜福利| 欧美精品人与动牲交sv欧美| av免费观看日本| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 看免费av毛片| 又黄又粗又硬又大视频| 国产乱来视频区| 99久久人妻综合| 两个人免费观看高清视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 国产av码专区亚洲av| 18在线观看网站| 少妇人妻 视频| 国产精品免费大片| av在线播放精品| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 午夜精品国产一区二区电影| 国产精品99久久99久久久不卡 | 国产精品无大码| 少妇人妻 视频| 一本色道久久久久久精品综合| 精品久久国产蜜桃| 久久ye,这里只有精品| 9色porny在线观看| 日本av手机在线免费观看| 五月天丁香电影| 一级爰片在线观看| 久久久久久久久久久久大奶| 国产片内射在线| 亚洲精品成人av观看孕妇| 两个人免费观看高清视频| 男的添女的下面高潮视频| 午夜激情久久久久久久| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 亚洲精品日韩在线中文字幕| 观看美女的网站| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲中文av在线| 最新的欧美精品一区二区| 日本与韩国留学比较| 成人手机av| 日韩精品有码人妻一区| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产高清三级在线| 久久久a久久爽久久v久久| 日韩成人伦理影院| 90打野战视频偷拍视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品一区二区在线不卡| 国产在视频线精品| 成人二区视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 成年动漫av网址| 岛国毛片在线播放| 国产成人精品在线电影| 成年美女黄网站色视频大全免费| 男女啪啪激烈高潮av片| 草草在线视频免费看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久久久网色| 午夜免费男女啪啪视频观看| 超色免费av| 青青草视频在线视频观看| 成人二区视频| 看十八女毛片水多多多| 99久久中文字幕三级久久日本| 大香蕉97超碰在线| 午夜免费观看性视频| 中文天堂在线官网| 国产综合精华液| 晚上一个人看的免费电影| 精品酒店卫生间| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产麻豆69| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 色婷婷av一区二区三区视频| 日本wwww免费看| 蜜桃国产av成人99| av黄色大香蕉| 天天影视国产精品| 深夜精品福利| av网站免费在线观看视频| av福利片在线| 少妇的逼好多水| 亚洲情色 制服丝袜| 日韩av在线免费看完整版不卡| 制服诱惑二区| 亚洲av福利一区| 国产免费视频播放在线视频| 日韩一区二区三区影片| 免费大片黄手机在线观看| 极品人妻少妇av视频| 高清欧美精品videossex| 亚洲三级黄色毛片| 欧美日韩精品成人综合77777| 丝袜美足系列| 久久毛片免费看一区二区三区| 一区二区三区精品91| 国产av国产精品国产| 精品亚洲成a人片在线观看| 天天操日日干夜夜撸| 伦理电影免费视频| 亚洲图色成人| 这个男人来自地球电影免费观看 | 欧美精品一区二区免费开放| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 在线观看一区二区三区激情| 只有这里有精品99| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲丝袜综合中文字幕| 中文字幕人妻熟女乱码| 精品一区二区三区视频在线| 捣出白浆h1v1| 大片电影免费在线观看免费| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产精品久久久久久久电影| 两个人看的免费小视频| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 99热全是精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| xxx大片免费视频| 久久人人爽人人片av| 免费大片黄手机在线观看| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成人免费观看视频高清| 777米奇影视久久| 少妇 在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 一区二区av电影网| 97精品久久久久久久久久精品| www.av在线官网国产| av免费在线看不卡| 热re99久久精品国产66热6| 成人亚洲精品一区在线观看| www.熟女人妻精品国产 | 成人国产av品久久久| 亚洲久久久国产精品| 一边摸一边做爽爽视频免费| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美人与善性xxx| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产成人91sexporn| 搡老乐熟女国产| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美人与善性xxx| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品一区在线观看国产| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 午夜老司机福利剧场| 性色av一级| 精品亚洲成国产av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 母亲3免费完整高清在线观看 | h视频一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 在线观看三级黄色| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 免费黄网站久久成人精品| 全区人妻精品视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 精品人妻在线不人妻| 成人黄色视频免费在线看| 亚洲高清免费不卡视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 1024视频免费在线观看| 国产精品一区二区在线不卡| 9热在线视频观看99| 青春草国产在线视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产成人精品久久久久久| 久久久久久伊人网av| 免费观看无遮挡的男女| www日本在线高清视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 久久av网站| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 多毛熟女@视频| 人妻少妇偷人精品九色| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 色视频在线一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 亚洲,欧美,日韩| 午夜av观看不卡| 午夜免费鲁丝| av线在线观看网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 精品一区二区三区视频在线| 久久久久久久久久人人人人人人| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产免费又黄又爽又色| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲人成网站在线观看播放| 男女啪啪激烈高潮av片| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲性久久影院| 99re6热这里在线精品视频| 飞空精品影院首页| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 一级,二级,三级黄色视频| 国产精品免费大片| 国产成人aa在线观看| 久久久精品免费免费高清| 亚洲av中文av极速乱| 久久ye,这里只有精品| 美女主播在线视频| 少妇的丰满在线观看| 亚洲国产色片| 久久久久久久久久人人人人人人| av国产精品久久久久影院| 精品视频人人做人人爽| 日韩大片免费观看网站| 亚洲美女搞黄在线观看| 中文欧美无线码| 五月天丁香电影| 看十八女毛片水多多多| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美激情 高清一区二区三区| 欧美精品国产亚洲| av在线app专区| 街头女战士在线观看网站| 老司机亚洲免费影院| 久久久久精品人妻al黑| 黄片播放在线免费| 少妇被粗大的猛进出69影院 | videossex国产| 高清视频免费观看一区二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲精品国产av蜜桃| 男女边摸边吃奶| 最近手机中文字幕大全| 看十八女毛片水多多多| 91在线精品国自产拍蜜月| 日韩电影二区| 五月玫瑰六月丁香| 乱码一卡2卡4卡精品| 午夜av观看不卡| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产精品久久久久久久电影| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 99国产精品免费福利视频| 久久久国产一区二区| 亚洲av在线观看美女高潮| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲精品第二区| 大话2 男鬼变身卡| 久久国内精品自在自线图片| 夫妻性生交免费视频一级片| 中文字幕av电影在线播放| 国产精品不卡视频一区二区| av一本久久久久| 国产精品久久久av美女十八| 久久这里只有精品19| 亚洲精品中文字幕在线视频| 91国产中文字幕| 水蜜桃什么品种好| 伊人亚洲综合成人网| 国产在视频线精品| 最近中文字幕2019免费版| 国精品久久久久久国模美| 免费看不卡的av| 少妇的逼好多水| 一级爰片在线观看| 精品久久蜜臀av无| 亚洲少妇的诱惑av| av福利片在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产熟女午夜一区二区三区| 国产亚洲一区二区精品| 久久99蜜桃精品久久| 亚洲人与动物交配视频| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲国产精品成人久久小说| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 老司机亚洲免费影院| 香蕉丝袜av| 一二三四中文在线观看免费高清| 女人久久www免费人成看片| 亚洲情色 制服丝袜| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 国产爽快片一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 最近2019中文字幕mv第一页| 久久免费观看电影| 2021少妇久久久久久久久久久| 成人免费观看视频高清| 男男h啪啪无遮挡| 欧美日本中文国产一区发布| 国产成人av激情在线播放| 中国美白少妇内射xxxbb| 国产男女内射视频| 国产精品久久久av美女十八| 精品久久蜜臀av无| 国产免费又黄又爽又色| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲少妇的诱惑av| 女人精品久久久久毛片| 丁香六月天网| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲伊人色综图| 精品国产一区二区久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 最黄视频免费看| 欧美亚洲日本最大视频资源| 最黄视频免费看| 黄色视频在线播放观看不卡| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 高清欧美精品videossex| 成人亚洲欧美一区二区av| 一区二区三区四区激情视频| 黄色一级大片看看| 高清不卡的av网站| videosex国产| 丝袜美足系列| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 99久国产av精品国产电影| 九九在线视频观看精品| 春色校园在线视频观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 一区二区三区乱码不卡18| 久久毛片免费看一区二区三区| 视频区图区小说| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 久久精品国产综合久久久 | 日本色播在线视频| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲在久久综合| 一边亲一边摸免费视频| 国产精品久久久久久久久免| 永久免费av网站大全| xxxhd国产人妻xxx| h视频一区二区三区| 人人妻人人澡人人看| 亚洲国产色片| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 男人舔女人的私密视频| 18在线观看网站| 我要看黄色一级片免费的| 99国产精品免费福利视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久精品国产亚洲av天美| 五月伊人婷婷丁香| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 97在线人人人人妻| xxx大片免费视频| 夜夜爽夜夜爽视频| 黑人猛操日本美女一级片| 国产又色又爽无遮挡免| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 一级黄片播放器| 成人免费观看视频高清| 五月开心婷婷网| 伊人亚洲综合成人网| 校园人妻丝袜中文字幕| av黄色大香蕉| 久久99蜜桃精品久久| 国产精品嫩草影院av在线观看| 免费看光身美女| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲国产精品国产精品| 日本av免费视频播放| 热99国产精品久久久久久7| 五月开心婷婷网| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 一级爰片在线观看| 欧美bdsm另类| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产综合精华液| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产片内射在线| 免费在线观看完整版高清| 黄片播放在线免费| 国产精品.久久久| av国产久精品久网站免费入址| 国产熟女欧美一区二区| 老司机影院成人| 亚洲av欧美aⅴ国产| 一级黄片播放器| 国产熟女午夜一区二区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久婷婷青草| 国产综合精华液| 国产在线免费精品| 国产在视频线精品| 国产永久视频网站| 婷婷色av中文字幕| 亚洲国产av影院在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 欧美成人精品欧美一级黄| 哪个播放器可以免费观看大片| 三上悠亚av全集在线观看| 成人黄色视频免费在线看| 黄色 视频免费看| 亚洲精品一二三| 国产精品欧美亚洲77777| 国产精品不卡视频一区二区| 在线观看免费高清a一片| 成年美女黄网站色视频大全免费| 国产成人aa在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日本vs欧美在线观看视频| 亚洲三级黄色毛片| 黄片播放在线免费| 夫妻性生交免费视频一级片| a 毛片基地| 只有这里有精品99| 99久久人妻综合| 午夜激情久久久久久久| 深夜精品福利| 好男人视频免费观看在线| 成人亚洲欧美一区二区av| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 18禁观看日本| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产 精品1| 成人黄色视频免费在线看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产片内射在线| 国产一区二区激情短视频 | 一级爰片在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 少妇高潮的动态图| 亚洲国产精品成人久久小说| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产男女内射视频| 欧美日本中文国产一区发布| 又黄又粗又硬又大视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 精品人妻一区二区三区麻豆| 国产片内射在线| 岛国毛片在线播放| 亚洲精品日本国产第一区| 一区二区三区精品91| av线在线观看网站| 有码 亚洲区| 免费大片黄手机在线观看| av不卡在线播放| 午夜日本视频在线| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久久国产一区二区| 国产成人一区二区在线| 久久午夜福利片| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品久久久久久久久免| 各种免费的搞黄视频| 热99久久久久精品小说推荐| 国产免费视频播放在线视频| 天天操日日干夜夜撸| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 日日撸夜夜添| 成人午夜精彩视频在线观看| 免费观看无遮挡的男女| 欧美精品一区二区大全| 久久久久久久国产电影| √禁漫天堂资源中文www| 日韩成人伦理影院| 黄片播放在线免费| av.在线天堂| 丰满饥渴人妻一区二区三| 少妇人妻久久综合中文| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 少妇被粗大的猛进出69影院 | 少妇被粗大的猛进出69影院 | 捣出白浆h1v1| 热99国产精品久久久久久7| 国产精品无大码| 一个人免费看片子| 9色porny在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 久久久精品区二区三区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品不卡视频一区二区| 一区二区三区乱码不卡18| 蜜臀久久99精品久久宅男| av黄色大香蕉| 亚洲国产精品一区三区| 99国产综合亚洲精品| 韩国av在线不卡| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲,欧美精品.| 高清欧美精品videossex| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产日韩欧美在线精品| 91在线精品国自产拍蜜月| 人成视频在线观看免费观看| 美女视频免费永久观看网站| 成人国产麻豆网| 另类亚洲欧美激情| av电影中文网址| 亚洲美女黄色视频免费看| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲美女视频黄频| 老女人水多毛片| 欧美精品国产亚洲| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产毛片在线视频| 黄色怎么调成土黄色| kizo精华| 一区二区三区四区激情视频| 人妻一区二区av| 男女边摸边吃奶| 国产黄色视频一区二区在线观看| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 啦啦啦啦在线视频资源| 五月伊人婷婷丁香| 国产在线一区二区三区精| 五月玫瑰六月丁香| 人妻 亚洲 视频| 午夜免费鲁丝| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产精品国产三级专区第一集| 晚上一个人看的免费电影| 日本vs欧美在线观看视频| 欧美97在线视频| 国产片内射在线| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 春色校园在线视频观看| 一级片免费观看大全| 99热这里只有是精品在线观看| 国产一区二区在线观看日韩| 丁香六月天网| 国产亚洲欧美精品永久| 久久亚洲国产成人精品v| av在线播放精品| 日本免费在线观看一区| 最近的中文字幕免费完整| av在线观看视频网站免费| 男人舔女人的私密视频| 久久久久视频综合| 精品人妻在线不人妻| 亚洲精品久久午夜乱码| 新久久久久国产一级毛片| 欧美精品一区二区大全| 亚洲欧美一区二区三区国产| 一级片免费观看大全| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 69精品国产乱码久久久| 老熟女久久久| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 伦精品一区二区三区| 99久久综合免费| 22中文网久久字幕| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 日本wwww免费看|