祛風(fēng)解痙湯治療咳嗽變異性哮喘的藥理作用

宋蘋 張溪 張瞳 張忠德

[摘要] 目的 初步探討祛風(fēng)解痙湯對(duì)咳嗽變異性哮喘（CVA）豚鼠氣道炎性反應(yīng)的影響作用。 方法 40只SPF級(jí)雌性豚鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、中藥高劑量組、中藥低劑量組，每組8只。采用雞清白蛋白（OVA）、氫氧化鋁腹腔注射致敏并OVA激發(fā)法復(fù)制CVA豚鼠模型。陽(yáng)性對(duì)照組、中藥高劑量組、中藥低劑量組于霧化當(dāng)天開始分別以醋酸潑尼松3 mg/kg、祛風(fēng)解痙湯32.88 g/kg、祛風(fēng)解痙湯8.22 g/kg灌胃。正常對(duì)照組及模型組給予等量的生理鹽水灌胃。檢測(cè)各組豚鼠咳嗽敏感性（CRS）、支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸粒細(xì)胞（EOS）百分率及血清中白介素-4（IL-4）、IL-12、IL-13、腫瘤壞死因子β（TNF-β）、γ干擾素（IFN-γ）水平。 結(jié)果 模型組CRS、EOS百分率及血清IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、INF-γ表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組、中藥高劑量組、中藥低劑量組豚鼠的CRS、EOS百分率明顯低于模型組，陽(yáng)性對(duì)照組及中藥高劑量組血清IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、INF-γ表達(dá)水平明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。③中藥高劑量組豚鼠CRS、EOS百分率及血清TNF-β、INF-γ表達(dá)水平明顯低于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）； 結(jié)論 祛風(fēng)解痙湯能明顯抑制CVA豚鼠CRS，降低CVA豚鼠BALF中EOS百分率，亦能一定程度減輕血清炎性因子表達(dá)，相關(guān)機(jī)制尚需優(yōu)化處方配伍深入探討。

[關(guān)鍵詞] 祛風(fēng)解痙湯；咳嗽變異性哮喘；咳嗽敏感性；氣道炎性反應(yīng)

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）08（a）-0014-04

[Abstract] Objective To preliminarily investigate the efficacy of Qufeng Jiejing Decoction on airway inflammation reaction in guinea pigs with cough variant asthma （CVA）. Methods Forty SPF female guinea pigs were divided into five groups with eight Digs in each group by random number table， including control group， model group， positive drug group， low-dose Qufeng Jiejing Decoction group and high-dose Qufeng Jiejing Decoction group. The OVA-induced method， by injecting OVA and aluminum hydroxide （ALP） intraperitoneally， was applied to make guinea pig CVA model. On the date of nebulization， the positive drug group， high-dose and low-dose Qufeng Jiejing Decoction groups were respectively treated with prednisone acetate at 3 mg/kg， Qufeng Jiejing Decoction at doses of 2.88 g/kg and 8.22 g/kg by gavage. The control group and model group were treated with normal saline at the same time. The cough response sensitivity （CRS）， eosinophil （EOS） percentage in bronchoalveolar lavage fluid （BLAF）， as well as levels of serum interleukin -4 （IL-4）， IL-12， IL-13， tumor necrosis factor β （TNF- β） and interferon-γ （IFN-γ） of each group were detected. Results Compared with the control group， the CRS， EOS percentage， and the expression levels of IL-4， IL-12， IL-13， TNF-β and INF-γ in serum of the model group were increased significantly （P < 0.05）. Compared with the model group， the CRS and EOS percentage were significantly decreased in the positive drug group， high-dose and low-dose Qufeng Jiejing Decoction group， while the levels of serum IL-4， IL-12， IL-13， TNF-β and INF-γ were significantly reduced （P < 0.05）. Compared with the low-dose Qufeng Jiejing Decoction group， the CRS， EOS percentage， and the levels of TNF-β and INF-γ in high-dose Qufeng Jiejing Decoction group were reduced significantly （P < 0.05）. Conclusion Qufeng Jiejing Decoction can evidently inhibit the CRS and the EOS percentage of CVA guinea pigs， and also reduce the expression of inflammatory cytokines in their serum to some extent. However， the relevant mechanism is worth investigating and needs further exploration.

[Key words] Qufeng Jiejing Decoction； Cough variant asthma； Cough sensitivity； Airway inflammation

咳嗽變異性哮喘（CVA）是一種常見的慢性咳嗽病因，約占慢性咳嗽原因的1/3[1]。在我國(guó)，受氣候、環(huán)境等各方面因素影響，CVA發(fā)病率不斷增加。而針對(duì)CVA的規(guī)范治療并未引起廣泛重視，而且部分患者因癥狀較輕或考慮到激素類藥物的副作用而拒絕用藥。近年來(lái)，隨著研究的深入，國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍認(rèn)為咳嗽敏感性增高以及相應(yīng)氣道神經(jīng)源性炎癥在慢性咳嗽發(fā)病中起重要作用[2-4]，CVA也存在咳嗽敏感性增高及氣道神經(jīng)源性炎癥改變，因此，抑制氣道神經(jīng)源性炎癥并降低咳嗽敏感性成為CVA靶向治療的有效途徑。中醫(yī)理論認(rèn)為，CVA的癥狀表現(xiàn)符合“風(fēng)性善行數(shù)變”“風(fēng)盛則攣急”“風(fēng)盛則癢”等特點(diǎn)，屬“風(fēng)咳”范疇。晁恩祥教授據(jù)此創(chuàng)立“疏風(fēng)宣肺、解痙止咳”治法[5-6]，在臨床應(yīng)用普遍。筆者在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)祛風(fēng)解痙立法的祛風(fēng)解痙湯對(duì)CVA早期治療有一定的優(yōu)勢(shì)。結(jié)合CVA的發(fā)病機(jī)制，本研究基于氣道神經(jīng)源性炎癥及咳嗽敏感性積極探討祛風(fēng)解痙湯的作用及機(jī)制，為該處方的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為其進(jìn)一步開發(fā)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2～3月齡，體重350～450 g的SPF級(jí)雌性豚40只，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：44002100006813。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 ①祛風(fēng)解痙湯由炙麻黃5 g（批號(hào)：170501601），地龍10 g（批號(hào)：170507561），蘇葉15 g（批號(hào)：170303603），蟬蛻6 g（批號(hào)：170408722），炙百部10 g（批號(hào)：170465433），炙紫苑10 g（批號(hào)：170523 526），前胡10 g（批號(hào)：170532143），五味子10 g（批號(hào)：170401732），桔梗10 g（批號(hào)：170304621）、甘草5 g（批號(hào)：170501601）組成，由廣東省中醫(yī)院中藥房提供。將上述中藥制成粗粉，首劑將粗粉放置8倍溫水浸泡0.5 h，沸騰后改文火煎0.5 h，均勻攪拌取汁后經(jīng)三層紗布過(guò)濾；第2次和第3次煎煮均分別以6倍水文火煎0.5 h，同樣方法取汁，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，水浴溫度設(shè)為55℃。根據(jù)人和豚鼠體表面積換算系數(shù)[7]，中藥低、高劑量組給藥劑量分別為8.22、32.88 g/kg，按照1 mL/200 g豚鼠給藥量將藥物濃縮至1.644、6.576 g/mL兩個(gè)不同濃度混懸液，4℃保存?zhèn)溆谩＂诖姿釢娔崴善簭S家浙江仙琚制藥股份有限公司；規(guī)格5 mg×100 s；批號(hào)：160337，給藥量為3 mg/kg。

1.1.3 儀器 醫(yī)用1205型壓縮霧化機(jī)（德國(guó)PARI公司）、玻璃霧化箱（自制），酶標(biāo)分析儀MK3（Thermo美國(guó)），普通光學(xué)顯微鏡（Nikon日本）等。

1.1.4 試驗(yàn)盒 白細(xì)胞介素4（IL-4）（Sigma，批號(hào)：RAB1529）、IL-12（Sigma，批號(hào)：RAB0255）、IL-13（Sigma，批號(hào)：RAB0256）、腫瘤壞死因β（TNF-β）（Sigma，批號(hào)：RAB0340）、γ干擾素（INF-γ）酶聯(lián)免疫試劑盒（Sigma，批號(hào)：RAB0224）。

1.2 試劑的配制

雞清白蛋白（OVA）溶液：將1 g OVA干粉（購(gòu)自GBCBIO Technologies）溶于50 mL生理鹽水中先配置成20 g/L OVA溶液，并用生理鹽水稀釋為10 g/L OVA溶液；氫氧化鋁干粉（購(gòu)自天津惠瑞化工科技有限公司，生產(chǎn)編號(hào)：20141111）；辣椒素溶液：取辣椒素（購(gòu)自SIGMA）30.5 mg，依次加入吐溫-80溶液及無(wú)水乙醇各1 mL溶解，再加入生理鹽水8.0 mL，配成10-2 mol/L的辣椒素原液，取1 mL的辣椒素原液，稀釋至100 mL成10-4mol/L溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將40只豚鼠在室溫18～24℃下飼養(yǎng)，濕度40%～70%，每天光照10～12 h，自由飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組，每組8只。①造模方法：造模組在第1、8天每只豚鼠腹腔注射20 g/L OVA 1 mL和200 mg氫氧化鋁的混懸液，第15天開始以10 g/L OVA霧化攻擊，1次/ d，每次1 h，連續(xù)7 d。正常對(duì)照組給予相同體積的生理鹽水腹腔注射及霧化。②給藥方法：于霧化攻擊當(dāng)天起灌胃給藥，陽(yáng)性對(duì)照組按照醋酸潑尼松3 mg/kg配成3 mL生理鹽水溶液灌胃，中藥低劑量組按照8.22 g/kg給予祛風(fēng)解痙湯低濃度混懸液灌胃，中藥高劑量組按照32.88 g/kg給予祛風(fēng)解痙湯高濃度混懸液灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。正常對(duì)照組和模型組以等體積生理鹽水灌胃。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在SPF級(jí)環(huán)境，12 h/12 h光照循環(huán)，自由飲水和食用顆粒飼料。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

①咳嗽敏感性：利用辣椒素咳嗽激發(fā)試驗(yàn)以及全身體積描記法計(jì)數(shù)結(jié)果作為判斷依據(jù)，即全部霧化攻擊完成后的第2天，置豚鼠于全身體描箱內(nèi)，以10-4 mol/L辣椒素溶液霧化2 min后，觀察并記錄各組豚鼠5 min的咳嗽次數(shù)。②支氣管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）百分率：激發(fā)試驗(yàn)結(jié)束后，以2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗支氣管肺泡，灌洗3次，回收支氣管BALF。取200 μL BALF離心（轉(zhuǎn)速：3000 r/min，離心半徑：15 cm）10 min；轉(zhuǎn)移上清液，加入紅細(xì)胞裂解液后，同上再離心l0 min；轉(zhuǎn)移上清液，加入等量PBS涂片，蘇木精-伊紅染色；顯微鏡下連續(xù)視野中觀察并計(jì)算200個(gè)細(xì)胞中EOS的百分率。再取100 μL BALF，同法操作，直至“加入等量PBS涂片”，取10 μL細(xì)胞計(jì)數(shù)。③血清炎性介質(zhì)：腹主動(dòng)脈采血5 mL，置促凝管靜置后離心（轉(zhuǎn)速：3000 r/min，離心半徑：15 cm）10 min，分離血清；采用酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、IFN-γ的含量測(cè)定，方法嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組豚鼠CRS及BALF中EOS百分率比較結(jié)果

模型組豚鼠的咳嗽次數(shù)及EOS百分率均明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），證明造模成功；陽(yáng)性對(duì)照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組豚鼠的咳嗽次數(shù)均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；中藥高劑量組豚鼠的咳嗽次數(shù)低于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。陽(yáng)性對(duì)照組、中藥低劑量組、中藥高劑量組EOS百分率均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；中藥高劑量組EOS百分率明顯低于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組豚鼠血清IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、INF-γ表達(dá)水平比較結(jié)果

模型組豚鼠IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、INF-γ的表達(dá)水平較明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；陽(yáng)性對(duì)照組、中藥高劑量組豚鼠IL-4、IL-12、IL-13、TNF-β、INF-γ表達(dá)水平均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；中藥低劑量組豚鼠IL-13表達(dá)水平明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；中藥高劑量組豚鼠的TNF-β、INF-γ水平明顯低于中藥低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

3 討論

祛風(fēng)解痙治法是基于哮喘急性發(fā)作時(shí)風(fēng)盛痰阻氣道攣急的病機(jī)而設(shè)，長(zhǎng)期以來(lái)，其在哮喘的診治中始終發(fā)揮著十分重要的作用[8]?；贑VA與哮喘發(fā)病的共同機(jī)制，該法在CVA的治療中得以廣泛應(yīng)用。本研究使用的祛風(fēng)解痙湯即是在該法指導(dǎo)下，經(jīng)筆者多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的處方。全方以炙麻黃、地龍為君藥，共奏疏風(fēng)宣肺、通絡(luò)解痙之效；蘇葉、蟬蛻、僵蠶為臣，疏風(fēng)止痙、利咽止癢；炙百部、炙紫菀、前胡宣肺化痰、止咳平喘，五味子斂肺止咳，共為佐使。

根據(jù)本研究結(jié)果，祛風(fēng)解痙湯在減輕CVA豚鼠CRS方面較陽(yáng)性對(duì)照藥更為有效，這可能與方中炙麻黃及蟲類藥物的使用有關(guān)。現(xiàn)代藥理研究表明，炙麻黃對(duì)支氣管平滑肌的解痙作用更為持久[9]；地龍中含氮化合物在離體實(shí)驗(yàn)中對(duì)小鼠及家兔表現(xiàn)出較強(qiáng)的支氣管舒張作用[10]；蟬蛻和僵蠶除具有抗變態(tài)反應(yīng)作用還能有效緩解支氣管平滑肌痙攣[11]。另外，有研究認(rèn)為，CVA可分為CRS增高和正常兩種亞型，而EOS在氣道浸潤(rùn)和活化程度不同可能是造成CVA模型CRS差異的重要原因[12]。由此，針對(duì)CRS增高的CVA患者，祛風(fēng)解痙湯可能是更為有效的治療選擇，而EOS在氣道浸潤(rùn)和活化程度中的不同作用則可作為其機(jī)制研究的途徑之一。本文研究結(jié)果顯示：中藥高劑量組較中藥低劑量組EOS百分率下降更明顯，提示祛風(fēng)解痙湯治療能夠有效降低CVA豚鼠BALF中的EOS百分率，并且可能與劑量有一定的相關(guān)性[13-15]。另外，與陽(yáng)性對(duì)照組比較，本研究采用的祛風(fēng)解痙湯在減輕CVA豚鼠性反應(yīng)方面的作用似乎并不理想，這可能與該處方的配伍有一定關(guān)系[16-20]?？v觀全方，更多的藥味作用體現(xiàn)在解痙平喘方面。因此，針對(duì)炎性反應(yīng)明顯的CVA患者，臨證實(shí)踐中可對(duì)該處方進(jìn)行適當(dāng)?shù)募訙p，從減輕CRS和炎性反應(yīng)等多方面全方位優(yōu)化處方，為CVA的治療提供更為有效的治療方法。

綜上，祛風(fēng)解痙湯能明顯抑制CVA豚鼠CRS，降低CVA豚鼠BALE中EOS百分率，亦能一定程度減輕血清炎性因子表達(dá)，其相關(guān)機(jī)制尚需優(yōu)化處方配伍深入探討。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組.咳嗽的診斷與治療指南（2015）[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2016，39（5）：31-32.

[2] 陳如沖，劉春麗，羅煒，等. 慢性咳嗽常見病因之間咳嗽敏感性的差異[J].中國(guó)呼吸與危重監(jiān)護(hù)雜志，2013，12（4）：384-389.

[3] 劉春麗，賴克方，鐘南山.氣道神經(jīng)源性炎癥與慢性咳嗽的發(fā)病機(jī)制[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)呼吸系統(tǒng)分冊(cè)，2004，24（4）：237-240.

[4] 韋杰.氣道神經(jīng)源性炎癥介質(zhì)在感染后慢性咳嗽發(fā)病機(jī)制中的作用[J].白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，10（5）：373-374.

[5] 楊玉萍，晁恩祥.國(guó)醫(yī)大師晁恩祥教授從風(fēng)論治呼吸疾病理論[J].中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（12）：3702-3704.

[6] 陳燕，張洪春，楊道文，等.晁恩祥教授“從風(fēng)論治”哮病的學(xué)術(shù)思想研究[J].中醫(yī)藥管理雜志，2007，15（4）：281-282.

[7] 章元沛.藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1996.

[8] 樊長(zhǎng)征，李友林.祛風(fēng)解痙湯治療哮喘病證的內(nèi)涵[J]. 國(guó)醫(yī)論壇，2007，22（3）：20-21.

[9] 景紅娟，汪長(zhǎng)東，甘露，等.麻黃堿抑制支氣管平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制[J].細(xì)胞生物學(xué)雜志，2008，30（5）：647-650.

[10] 顧超，李海燕，湯杰，等.淺談蟲類藥在支氣管哮喘治療中的作用[J].臨床肺科雜志，2012，17（2）：322-323.

[11] 文丹丹，王敏.蟬蛻及其配伍治療哮喘的研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（3）：242-245.

[12] 黃漾，邱志宏，魏為利，等.咳嗽敏感性和咳嗽變異性哮喘的比較研究[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，32（1）：68-72.

[13] 王雨墨，吳麗霞，張弘，等.王坤根教授應(yīng)用祛風(fēng)法治療咳嗽變異性哮喘的經(jīng)驗(yàn)[J].山西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017， 40（2）：24-26.

[14] 江君萍.祛風(fēng)化痰宣肺平喘方聯(lián)合沙美特羅替卡松粉霧化吸入治療咳嗽變異性哮喘風(fēng)痰交阻證臨床療效[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2017，26（6）：1038-1040.

[15] 龔錦.祛風(fēng)止咳湯聯(lián)合孟魯斯特鈉治療咳嗽變異性哮喘（CVA）隨機(jī)平行對(duì)照研究[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2017，31（6）：34-36.

[16] 康年松，馬偉明，陳笑騰，等.蟬衣合劑加減治療咳嗽變異性哮喘臨床療效觀察[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2017， 27（2）：123-125.

[17] 陳燕，朱佳.從內(nèi)外風(fēng)合病論治咳嗽變異性哮喘[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，36（2）：112-114.

[18] 黃珍愷，吳孝田，趙祥安，等.祛風(fēng)止咳湯治療CVA患者44例臨床觀察[J].光明中醫(yī)，2017，24（19）：2780-2782.

[19] 余嫻.風(fēng)藥對(duì)咳嗽變異性哮喘的療效觀察[J].四川中醫(yī)，2017，36（2）：130-132.

[20] 朱黎紅，丁旭春.滋陰潤(rùn)肺祛風(fēng)解痙湯治療感染后咳嗽52例臨床觀察[J].浙江中醫(yī)雜志，2013，20（5）：332.