體外受精-胚胎移植對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的影響研究

趙亮，張蕾，孫麗芳，王穎，于麗，鄭秀麗，劉靜芳，鄭蓉

(1.北京積水潭醫(yī)院，北京 100035；2.北京清華長(zhǎng)庚醫(yī)院，北京 102218；3.北京大學(xué)第三醫(yī)院，北京 100191；4.北京大學(xué)北大醫(yī)院，北京 100034)

輔助生殖技術(shù)(ART)安全性一直廣受關(guān)注，流行病學(xué)調(diào)查顯示，即使經(jīng)過(guò)混雜因素的調(diào)整，輔助生殖圍產(chǎn)期合并癥發(fā)病率高于普通人群，其病理生理機(jī)制與胎盤(pán)發(fā)育不良有關(guān)，表現(xiàn)為胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲能力下降，對(duì)子宮螺旋動(dòng)脈重塑不足[1]。類(lèi)似地，在幾種動(dòng)物模型中，IVF-ET比自然受孕存在高發(fā)病率的胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常[2]。絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，在細(xì)胞核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面具有重要作用，參與細(xì)胞分化、發(fā)育、分裂等多種生理功能，對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞的黏附、侵襲功能起關(guān)鍵作用[3]。本研究排除不孕因素后，以自然妊娠為對(duì)照，對(duì)IVF-ET來(lái)源的早期胎盤(pán)絨毛組織進(jìn)行基因芯片研究，探討IVF-ET技術(shù)對(duì)早期胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路的功能影響，以尋找表達(dá)差異的基因和調(diào)控機(jī)制，從胎盤(pán)早期發(fā)育視角初步探討輔助生殖安全性以及可能的病理生理機(jī)制。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2014～2017年在北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖中心接受IVF-ET治療并行雙胚胎移植的28例孕婦作為研究組(IVF-ET組)，同期在醫(yī)院計(jì)劃生育手術(shù)室行雙胎妊娠人工流產(chǎn)的8例孕婦作為對(duì)照組。研究組入選標(biāo)準(zhǔn)為：年齡30～35歲，因輸卵管因素接受IVF-ET治療后雙胚胎移植，雙絨毛膜雙胎，妊娠7～8周超聲引導(dǎo)下減為單胎(因高血壓、子宮畸形等客觀因素或患者要求進(jìn)行減胎)，剩余胚胎妊娠經(jīng)過(guò)正常，無(wú)妊娠并發(fā)癥及出生缺陷。臨床資料通過(guò)北京大學(xué)第三醫(yī)院生殖中心數(shù)據(jù)庫(kù)收集。對(duì)照組收集同期年齡相當(dāng)、孕齡相當(dāng)，流產(chǎn)前經(jīng)B超確認(rèn)絨毛膜性的自然妊娠雙絨毛膜雙胎，人工流產(chǎn)采用物理方法擴(kuò)張宮頸管，不使用前列腺素藥物。本研究方案和標(biāo)本獲取均經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)，兩組孕婦均簽署知情同意書(shū)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.胎盤(pán)絨毛收集：IVF-ET組標(biāo)本獲取：患者排空膀胱，采用膀胱截石體位，常規(guī)消毒鋪巾，采用穿刺針導(dǎo)架的無(wú)菌探頭套陰道探頭，檢查孕囊數(shù)量、位置，使用16G雙腔穿刺針，超聲引導(dǎo)下穿刺陰道及子宮壁，刺入目標(biāo)胚胎，用20 ml注射器抽吸胚胎，吸出胚胎組織或目標(biāo)胚胎胎心搏動(dòng)消失，在穿刺針退出的時(shí)候，在胚胎和子宮內(nèi)膜交界處吸取胎盤(pán)絨毛組織。立即置于熱臺(tái)倒置顯微鏡下純化胎盤(pán)絨毛，送少量絨毛組織到細(xì)胞遺傳實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核型檢測(cè)，絨毛染色體正常的組織進(jìn)行后續(xù)研究。對(duì)照組收集的人工流產(chǎn)絨毛組織進(jìn)行同樣的純化及核型檢測(cè)。

2.胎盤(pán)絨毛RNA提?。河杀本┎W生物有限公司完成絨毛組織勻漿，使用Macherey Nagel NucleoSpin RNAⅡkit試劑盒(迪倫，德國(guó))完成RNA提取及后續(xù)基因芯片檢測(cè)。對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，核糖體28S和18S RNA比值為1.0～1.5∶1之間，符合研究質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.基因芯片分析：采用等量胎盤(pán)絨毛總RNA(2 μg)合成雙鏈cDNA，MessageAmpⅡaRNA Amplification Kit(Ambion，美國(guó))生物素標(biāo)記獲得cRNA。按照Affymetrix基因芯片方法指南將cRNA片段化，生成35～200 bp的cRNA。采用美國(guó)Affymetrix公司U133 plus 2.0芯片，芯片雜交爐640在45℃下旋轉(zhuǎn)雜交16 h，基因芯片射流站450對(duì)芯片進(jìn)行洗滌、染色(鏈霉親和藻紅蛋白)，掃描儀3000和GCOS1.4分析基因芯片結(jié)果(上述儀器均購(gòu)自美國(guó)Affymetrix公司)。采用二分類(lèi)、非配對(duì)方法，Significance Analysis of Microarrays SAM version 3.02軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)和分析，篩選差異表達(dá)基因。采用無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)軟件Cluster 3.0 & TreeView對(duì)差異表達(dá)基因制圖分析。

4.實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)：qRT-PCR方法驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。選擇MAPK信號(hào)通路中8個(gè)差異基因進(jìn)行驗(yàn)證。RNA來(lái)自基因芯片檢測(cè)及組內(nèi)所有標(biāo)本(IVF-ET組28例，對(duì)照組8例)。第一鏈互補(bǔ)合成反應(yīng)采用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物，大連)。qRT-PCR儀PRISM7300(ABI，美國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，GAPDH內(nèi)參，qRT-PCR檢測(cè)引物詳見(jiàn)表1。每個(gè)qRT-PCR反應(yīng)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次，結(jié)果分析采用DDCt方法。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 qRT-PCR引物序列和擴(kuò)增長(zhǎng)度

結(jié) 果

一、胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞基因表達(dá)譜芯片結(jié)果

IVF-ET組與對(duì)照組的病例資料特點(diǎn)見(jiàn)表2(每組各4例，均滿(mǎn)足統(tǒng)計(jì)學(xué)要求)。SAM軟件分析發(fā)現(xiàn)，在妊娠7周胎盤(pán)絨毛組織中，IVF-ET組與對(duì)照組在MAPK信號(hào)通路中共有32個(gè)差異基因表達(dá)(差異表達(dá)倍數(shù)≥2倍)，13個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，19個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，詳見(jiàn)熱圖(圖1)和散點(diǎn)圖(圖2)。利用無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)軟件對(duì)胎盤(pán)絨毛組織差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果以TreeView顯示，8例樣本被聚為兩大類(lèi)，可見(jiàn)與IVF-ET組胎盤(pán)絨毛組織和對(duì)照組的區(qū)分完全一致，差異明顯，見(jiàn)圖3。

表2 基因芯片病例資料

二、差異基因名稱(chēng)以及Ontology功能分析

IVF-ET組與對(duì)照組共有32個(gè)差異基因表達(dá)(差異表達(dá)倍數(shù)≥2倍)，其中13個(gè)基因上調(diào)，19個(gè)基因下調(diào)，這些差異基因的名稱(chēng)、生物功能和染色體定位等分析見(jiàn)表3。

IVF-ET組與對(duì)照組胎盤(pán)絨毛組織中MAPK信號(hào)通路基因成員的差異表達(dá)情況，紅色代表基因表達(dá)上調(diào)，綠色代表基因表達(dá)下調(diào)圖1 熱圖

IVF-ET組與對(duì)照組胎盤(pán)絨毛組織中MAPK信號(hào)通路基因成員的差異表達(dá)情況，Up(紅色)代表基因表達(dá)上調(diào)，Down(綠色)代表基因表達(dá)下調(diào)，X和Y軸分別以熒光信號(hào)強(qiáng)度為坐標(biāo)軸，每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因熒光信號(hào)強(qiáng)度圖2 散點(diǎn)圖

無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析顯示IVF-ET組與對(duì)照組胎盤(pán)絨毛組織中MAPK信號(hào)通路基因成員的差異表達(dá)，粉色代表IVF-ET組，綠色代表對(duì)照組圖3 無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析

基因基因編碼基因名稱(chēng)基因生物過(guò)程基因細(xì)胞組份染色體定位表達(dá)倍數(shù)q值PLA2G12B231009_at磷脂酶A2,組XIIB脂質(zhì)分解代謝過(guò)程細(xì)胞外區(qū)域chr10q22.112.280JUN201466_s_atJun原癌基因血管生成激活核染色體chr1p32-p319.690RPS6KA3226335_at核糖體蛋白S6激酶,90 kDa,多肽3骨架系統(tǒng)開(kāi)發(fā)核chrXp22.2-p22.18.230ACVR1B213198_at活化素A受體,IB型有絲分裂細(xì)胞周期的G1/S轉(zhuǎn)換質(zhì)膜chr12q138.080FGF18231382_at成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子18骨化,血管生成細(xì)胞外區(qū)域chr5q346.860.01PRKACB202741_at蛋白激酶,cAMP依賴(lài)性,催化性β碳水化合物代謝過(guò)程,葡萄糖代謝過(guò)程核chr1p31.15.130RASGRP3205801_s_atRAS脒釋放蛋白3(鈣和DAG調(diào)節(jié))MAPK級(jí)聯(lián)細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞質(zhì)chr2p25.1-p24.14.500PLA2G4A210145_at磷脂酶A2,IVA組(胞質(zhì),鈣依賴(lài)性)卵巢卵泡排卵,黃體分解膜分?jǐn)?shù)chr1q254.080.01FGFR4204579_at成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體4器官誘導(dǎo)細(xì)胞外區(qū)域chr5q35.1-qter3.820.01PDGFRA203131_at血小板衍生的生長(zhǎng)因子受體,α多肽黃體化核chr4q123.700.01CACNB2213714_at鈣通道,電壓依賴(lài)性,beta 2亞基運(yùn)輸質(zhì)膜chr10p123.600RPS6KA2212912_at核糖體蛋白S6激酶,90 kDa,多肽2有絲分裂中期核chr6q273.570SOS1227426_at鳥(niǎo)苷酸交換因子1(果蠅)凋亡過(guò)程細(xì)胞內(nèi)chr2p213.550STK41569791_at絲氨酸/蘇氨酸激酶4細(xì)胞形態(tài)發(fā)生核chr20q11.2-q13.20.440.01GNG12212294_at鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(G蛋白)γ12能量?jī)?chǔ)備代謝過(guò)程異三聚體G蛋白復(fù)合物chr1p31.30.480MAPK9210570_x_at絲裂原活化蛋白激酶9MAPK級(jí)聯(lián)核chr5q350.340DUSP16224832_at雙特異性磷酸酶16MAPK活性的失活核chr12p130.440.01IL1R2211372_s_at白細(xì)胞介素1受體Ⅱ型免疫反應(yīng)細(xì)胞外區(qū)域chr2q120.290MAP3K8235421_at絲裂原活化蛋白激酶激酶8MAPK級(jí)聯(lián)細(xì)胞質(zhì)chr10p11.230.290BRAF236402_atv-raf鼠肉瘤病毒致癌基因同系物B1MAPK級(jí)聯(lián)膜分?jǐn)?shù)chr7q340.390STK3211078_s_at絲氨酸/蘇氨酸激酶3神經(jīng)管形成核chr8q22.20.230HSPA2211538_s_at熱休克70 kDa蛋白2對(duì)壓力的回應(yīng)細(xì)胞表面chr14q24.10.230HSPB1201841_s_at熱休克27 kDa蛋白1血管生成蛋白酶體復(fù)合物chr7q11.230.210DUSP4204015_s_at雙特異性磷酸酶4MAPK級(jí)聯(lián)可溶性部分chr8p12-p110.170EGFR224999_at表皮生長(zhǎng)因子受體MAPK級(jí)聯(lián)高爾基膜chr7p120.240.01IL1R1215561_s_at白細(xì)胞介素1受體I型免疫反應(yīng)細(xì)胞外區(qū)域chr2q120.310.01TGFB1203085_s_at轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1蛋白質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核,易位細(xì)胞外區(qū)域chr19q13.10.140RASA1202677_atRAS p21蛋白激活劑(GTPase激活蛋白)1胞質(zhì)分裂細(xì)胞內(nèi)chr5q13.30.120RPS6KA5204635_at核糖體蛋白S6激酶,90 kDa多肽5細(xì)胞因子產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控核chr14q31-q32.10.110GADD45G204121_at生長(zhǎng)停滯和DNA損傷誘導(dǎo)的γ激活MAPKKK活性核chr9q22.1-q22.20.090PLA2G2A203649_s_at磷脂酶A2,IIA族(血小板,滑液)磷脂代謝過(guò)程細(xì)胞外區(qū)域chr1p350.070DUSP5209457_at雙特異性磷酸酶5MAPK活性的失活核chr10q250.060

注：基因信息注釋來(lái)源：http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/Genebank/；http：∥www.geneontology.org/;紅色代表表達(dá)上調(diào)基因，綠色代表表達(dá)下調(diào)的基因

三、qRT-PCR驗(yàn)證胎盤(pán)MAPK信號(hào)通路部分基因成員mRNA的差異表達(dá)情況

采用qRT-PCR驗(yàn)證基因芯片檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)圖4。結(jié)果分別以GAPDH為對(duì)照，與對(duì)照組相比，來(lái)源于 IVF-ET組的胎盤(pán)絨毛組織中，JUN、PLA2G4A、PDGFRA和SOS1基因表達(dá)顯著上調(diào)(P均<0.05)，MAPK9、EGFR、TGFB1和GADD45G基因表達(dá)顯著下調(diào)(P均<0.05)，qRT-PCR結(jié)果和基因芯片的檢測(cè)結(jié)果相一致，說(shuō)明基因芯片的結(jié)果具有很高的可信度。

qRT-PCR驗(yàn)證表達(dá)基因芯片MAPK信號(hào)通路的8個(gè)基因 JUN、PLA2G4A、PDGFRA、SOS1、MAPK9、EGFR、TGFB1和GADD45G的表達(dá)。紅色柱子顯示上調(diào)基因 mRNA的表達(dá)，綠色柱子顯示下調(diào)基因mRNA的表達(dá)，藍(lán)色柱子顯示對(duì)照組的基因mRNA的表達(dá)，相互比較,*P<0.05，**P<0.01圖4 qRT-PCR比較IVF-ET組和對(duì)照組胎盤(pán)MAPK信號(hào)通路基因成員mRNA差異表達(dá)情況

四、IVF-ET技術(shù)影響胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路成員基因的表達(dá)

IVF-ET技術(shù)對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路成員基因表達(dá)的影響。圖5顯示差異表達(dá)基因的名稱(chēng)以及在MAPK信號(hào)通路中的位置和相互調(diào)節(jié)關(guān)系。可見(jiàn)IVF-ET技術(shù)影響MAPK信號(hào)通路上游基因的表達(dá)，胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞通過(guò)基因差異表達(dá)的代償作用，以基本保證MAPK信號(hào)通路行駛基本功能。

IVF-ET技術(shù)對(duì)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路成員基因表達(dá)的影響，顯示MAPK信號(hào)通路中基因表達(dá)的變化及所處的位置和相互調(diào)節(jié)關(guān)系，紅色代表基因表達(dá)上調(diào)，綠色代表基因表達(dá)下調(diào)圖5 輔助生殖技術(shù)對(duì)MAPK信號(hào)通路基因表達(dá)影響

討 論

胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞是妊娠過(guò)程中最活躍的細(xì)胞之一，其發(fā)育和侵襲過(guò)程受到時(shí)間和空間的嚴(yán)格精細(xì)調(diào)控[4]，對(duì)其調(diào)節(jié)失控會(huì)導(dǎo)致各種疾病[5]。MAPK是人滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)存在的一族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶[6]。各種MAPK通路完成不同的功能，傳遞細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜信號(hào)，最后表現(xiàn)為細(xì)胞的行為發(fā)生改變[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，IVF-ET胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α多肽(PDGFRA)基因高表達(dá)。PDGFRA主要參與MAPK的蛋白激酶(ERK)信號(hào)通路，在表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和血小板生長(zhǎng)因子(PDGF)的刺激下，調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)因子、應(yīng)激刺激、細(xì)菌產(chǎn)物和炎癥介質(zhì)的細(xì)胞反應(yīng)[8]，這表明IVF-ET技術(shù)本身存在應(yīng)激、細(xì)菌感染和炎癥介質(zhì)等可能，相比較自然妊娠，IVF-ET一定程度激活MAPK的ERK信號(hào)通路。本研究中，IVF-ET胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路原癌基因(JUN)表達(dá)上調(diào)，見(jiàn)表3和圖4，JUN主要參與MAPK的JNK信號(hào)通路，該信號(hào)通路主要被生長(zhǎng)因子、脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1)、紫外線、射線、熱休克、細(xì)胞外高滲及DNA變性劑等激活[9]。IVF-ET來(lái)源的JUN高表達(dá)，顯示MAPK的JNK信號(hào)通路激活，轉(zhuǎn)而磷酸化轉(zhuǎn)錄因子C-JUN的氨基末端特定位點(diǎn)，C-JUN是序列特異性轉(zhuǎn)錄激活因子激活蛋白1(AP-1)的成分之一，磷酸化的C-JUN通過(guò)誘導(dǎo)同源或異源二聚體形成，與AP-1位點(diǎn)的順式作用元件結(jié)合而啟動(dòng)某些效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，IVF-ET胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路熱休克蛋白1(HSPB1)和熱休克蛋白2(HSPA2)低表達(dá)，見(jiàn)圖1和表3。HSPB1和HSPA2主要參與MAPK的p38信號(hào)通路，熱休克、紫外線照射、細(xì)菌成分、IL-3和促紅細(xì)胞生成素(EPO)均能激活這條通路[11]，p38主要散在分布滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞漿，受到熱休克等刺激后，p38被激活并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，能激活滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子激活轉(zhuǎn)錄因子2(ATF2)、C/EBP同源蛋白10(CHOP10)、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2C(MEF2C)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子磷酸化來(lái)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)是MAPK信號(hào)通路的重要功能[12]。p38還能激活滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)的一些蛋白激酶，包括MAPK激活蛋白激酶2和3(MAPKAPK2和3)和p38調(diào)節(jié)/激活蛋白激酶2和3(PRAK)[13]，這些絲氨酸/蘇氨酸家族成員被磷酸化激活后，進(jìn)一步激活低分子量熱休克蛋白(HSP27)，介導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞骨架的重構(gòu)，進(jìn)而參與滋養(yǎng)層細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)[14]，p38亞族不同激酶可以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)特定部位而發(fā)揮不同的調(diào)節(jié)功能。

IVF-ET胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路Hspb1和Hspa2表達(dá)下調(diào)，顯示一種滋養(yǎng)層細(xì)胞保護(hù)性代償，代償過(guò)度表達(dá)MAPK信號(hào)通路刺激因子。本研究中也發(fā)現(xiàn)，IVF-ET胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路生長(zhǎng)阻滯和DNA損傷基因(GADD45a)表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖1、圖4和表3。GADD45a不僅在滋養(yǎng)層細(xì)胞DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到級(jí)聯(lián)橋梁作用，也是參與p38 MAPK和線粒體介導(dǎo)的重要凋亡誘導(dǎo)基因[15]。同時(shí)GADD45a通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路促進(jìn)胎盤(pán)產(chǎn)生的活性分子溶性血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-1(sFlt-1)和可溶性?xún)?nèi)皮(sEng)進(jìn)入母血循環(huán)，導(dǎo)致母體血管內(nèi)皮功能障礙和滋養(yǎng)層細(xì)胞功能異常[16]。先兆子癇患者胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞GADD45a高表達(dá)和孕婦血清sFlt-1、sEng水平具有相關(guān)性。IVF-ET胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路GADD45a表達(dá)下調(diào)顯示一種保護(hù)性代償機(jī)制，減少M(fèi)APK信號(hào)通路過(guò)度活化，如果胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞缺血、缺氧和損傷超過(guò)胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞自身代償限度，則GADD45a表達(dá)上調(diào)，加重胎盤(pán)缺血缺氧從而產(chǎn)生更多sFlt-1、sEng，形成惡性循環(huán)導(dǎo)致先兆子癇發(fā)生[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)基因表達(dá)下調(diào)，表皮生長(zhǎng)因子(EGF)作為細(xì)胞外刺激信號(hào)通過(guò)MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)金屬蛋白酶(MMPs)和組織抑制劑(TIMPs)基因和蛋白表達(dá)，從而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲和血管重鑄[18]。

ART相關(guān)的潛在表觀遺傳風(fēng)險(xiǎn)越來(lái)越受到關(guān)注。本文探討IVF-ET來(lái)源早期胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路基因的表達(dá)，研究結(jié)果與ART相關(guān)不良妊娠結(jié)局與異常滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲相關(guān)的假說(shuō)相一致[19]。IVF-ET技術(shù)可能影響胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞發(fā)育和功能，大多數(shù)情況，胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞通過(guò)代償作用來(lái)增加侵襲能力以及對(duì)炎癥、細(xì)菌和損傷的修復(fù)能力以及調(diào)整細(xì)胞骨架適應(yīng)滲透壓和氧化應(yīng)激，最終成功維持妊娠和正常胎兒發(fā)育[20]。同時(shí)，如果外界損傷過(guò)強(qiáng)，或者胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞代償作用不堪重負(fù)，則導(dǎo)致不同程度的不良妊娠結(jié)局，包括流產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩和妊娠期高血壓等[21]。我們對(duì)胎盤(pán)這種代償機(jī)制和風(fēng)險(xiǎn)還不十分了解，胚胎可能留存妊娠期間表觀遺傳適應(yīng)機(jī)制的痕跡，加劇成年期的代謝性疾病風(fēng)險(xiǎn)[22]。ART改變胎盤(pán)和胎兒生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)可能與各種生物學(xué)途徑中的修飾有關(guān)，目前調(diào)整胎盤(pán)代償系統(tǒng)和完整網(wǎng)絡(luò)仍然模糊[23]。本研究提供IVF-ET技術(shù)早期胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞MAPK信號(hào)通路基因表達(dá)變化、在通路中定位以及相互的調(diào)節(jié)關(guān)系，見(jiàn)圖5，這有助于ART技術(shù)改善和安全性提高，以確保整個(gè)ART過(guò)程更加接近自然妊娠經(jīng)過(guò)和結(jié)局。