• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    精子CatSper2的表達水平與不同精液參數(shù)及妊娠結(jié)局關(guān)系的初步研究

    2018-09-17 01:45:50李偉偉史鴻志殷秀榮閆婭妮馬波
    生殖醫(yī)學雜志 2018年9期
    關(guān)鍵詞:受精率精液精子

    李偉偉,史鴻志,殷秀榮,閆婭妮,馬波

    (河北省秦皇島市婦幼保健院生殖醫(yī)學科,秦皇島 066004)

    世界范圍內(nèi)已婚孕齡夫婦存在生育困難的發(fā)病率高達10%~15%,男女因素大約各占50%[1-2]。輔助生殖技術(shù)已經(jīng)成為治療不孕不育癥的重要手段。目前普遍認為精子功能缺陷是造成男性不育的最主要原因之一。精子特異性鈣離子通道(CatSper)共有4個成員CatSper1、CatSper2、CatSper3和CatSper4,CatSper1、CatSper2位于精子尾部,主要對精子鞭毛起作用,在增強精子運動、受能、超活化等方面起作用;CatSper3、CatSper4位于精子頭部,主要在頂體反應(yīng)過程中起作用。CatSper是目前公認的精子細胞上最重要的鈣離子通道。近年來有研究表明,CatSper2與男性不育存在相關(guān)性[3],但目前關(guān)于CatSper2的研究大多集中在結(jié)構(gòu)和功能方面[4-7],尚缺少CatSper與輔助生殖技術(shù)關(guān)系的研究。本文旨在通過研究CatSper2與體外受精(IVF)的受精率、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局的關(guān)系,從而為改善不育癥患者的助孕結(jié)局提供一定參考。

    資料與方法

    一、研究對象及分組

    回顧性分析2016年4月至2018年2月于我院生殖中心進行常規(guī)IVF治療的112例夫妻雙方的臨床資料,納入標準:女方年齡24~37歲,男方年齡25~40歲;男方無吸煙史、酗酒史、放射線暴露史;夫妻雙方染色體均正常;無遺傳病家族史,無近期泌尿生殖系統(tǒng)感染;有胚胎形成,均為首次行IVF。

    分組情況:(1)取卵日男方取精完畢后,先行精液常規(guī)分析,根據(jù)精液情況分為兩組:精液正常組(46例):精子濃度>15×106/ml、前向運動精子>32%、正常精子形態(tài)>4%;少弱精子組(66例):精子濃度<15×106/ml、前向運動精子<32%、正常精子形態(tài)<4%。各組納入標準:精液正常組均為女方單純輸卵管性不孕;少弱精子組中女方無其他不孕相關(guān)疾病。(2)根據(jù)取卵日男方精液的濃度將所有研究對象分為兩組:高濃度組(76例):精子濃度>15×106/ml;低濃度組(36例):5×106/ml<精子濃度<15×106/ml。(3)根據(jù)受精率將所有研究對象分為3組:A組(25例):受精率<30%;B組(37例):30%<受精率<60%;C組(50例):受精率>60%。(4)根據(jù)優(yōu)質(zhì)胚胎率和可利用胚胎率將所有研究對象分為4組:Q1組(67例):優(yōu)質(zhì)胚胎率>30%;Q2組(45例):優(yōu)質(zhì)胚胎率<30%;Q3組(66例):可利用胚胎率>50%;Q4組(46例)可利用胚胎率<50%。(5)將104例新鮮周期移植患者根據(jù)是否獲得臨床妊娠分為兩組:臨床妊娠組42例和未妊娠組56例,另外有6例早期流產(chǎn)患者未納入分組。

    二、研究方法

    1.控制性促排卵(COH):納入研究的患者均采用常規(guī)促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a)長方案COH,達到降調(diào)標準后,應(yīng)用重組人促卵泡激素(Gonal-F,默克雪蘭諾,法國)啟動促排卵。監(jiān)測卵泡直徑以及子宮內(nèi)膜的發(fā)育情況,Gn和GnRH-a種類及劑量的給予根據(jù)卵泡發(fā)育的大小和激素水平進行調(diào)整。當2~3個主導卵泡直徑>18 mm時,停用Gn和GnRH-a;當晚20時注射HCG 5 000~10 000 U,36 h后經(jīng)陰道超聲引導下取卵[8],所有研究對象的受精方式均采用IVF。

    2.精液常規(guī)分析:將IVF授精后剩余的精子應(yīng)用markler精子計數(shù)板進行常規(guī)分析,項目包括精子的濃度、前向運動精子的百分率以及精子形態(tài)學分析等,指標評價參照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版[9]標準。所有精液標本的處理由1名規(guī)范化培訓合格的技術(shù)人員操作,充分混勻精液標本,進行3次計數(shù),取平均值。形態(tài)學分析采用快速染色方法,參照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》第5版進行。

    3.精子mRNA提取和逆轉(zhuǎn)錄:取卵日,將液化后的精液緩慢加入密度梯度液上層,500g離心15 min后洗滌沉淀,棄上清;沉淀混勻后輕輕加入裝有0.5 ml培養(yǎng)液的試管底部置培養(yǎng)箱,傾斜45度上游30 min,待授精。授精后剩余的精子PBS洗滌兩次后用于提取mRNA。利用Trizol試劑(Invitrogen,美國)提取總RNA。適量的DEPC水溶解RNA沉淀,-70℃保存?zhèn)溆谩H∵m量總RNA稀釋后用分光光度計測定OD260/OD280,比值均在1.8~2.0。計算濃度后備用。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng):逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒購自立陶宛Fermantas公司,操作嚴格按照說明書進行,產(chǎn)物于-70℃保存待用。

    精子純化:為了確保所檢測到的mRNA是成熟精子中的mRNA,上游后的精子經(jīng)PBS洗滌后,用0.4%伊紅Y染色30 min后顯微鏡下觀察。純化標準:在顯微鏡下確認無圓形細胞或殘余體。

    4.聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增:引物設(shè)計:從Gen Bank查詢CatSper2的mRNA基因序列AF411816,引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件完成,序列如表1。應(yīng)用DNA作為模板,建立25 μl PCR體系:2×Taq酶PCR反應(yīng)混合液12.5 μl,20 μmol/L引物各1.5 μl,模板DNA 2.0 μl,重蒸餾水 7.5 μl。PCR反應(yīng)條件:94℃預變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸45 s,共35個循環(huán),最后72℃延伸10 min,降至4℃保溫。擴增片段長度為261 bp。凝膠電泳觀察結(jié)果。用Quantity-one軟件分析,以目的基因與內(nèi)參基因β-actin灰度比值表示目的基因的相對含量。

    表1 引物序列

    5.觀察指標及判斷標準:精卵共培養(yǎng)18~20 h后觀察雙原核(2PN)情況,受精率=2PN數(shù)/獲卵數(shù)。培養(yǎng)第3天(D3)行胚胎評分,根據(jù)卵裂球的數(shù)量、均勻程度及是否有碎片,按胚胎評分法[10]對D3胚胎進行評分:(1)Ⅰ級胚胎:細胞均勻,形狀規(guī)則,碎片在0~5%之間;(2)Ⅱ級胚胎:細胞大小均勻,形狀略不規(guī)則,胞質(zhì)可有顆?,F(xiàn)象,碎片在5%~10%之間;(3)Ⅲ級胚胎:細胞大小均勻,可有明顯的形狀不規(guī)則,胞質(zhì)可有顆粒,碎片在10%~25%之間;(4)Ⅳ級胚胎:細胞大多不均勻,胞質(zhì)可有嚴重顆?,F(xiàn)象,碎片在25%以上。D3優(yōu)質(zhì)胚胎:來源于正常受精卵,受精后D3胚胎細胞數(shù)為7~9個,碎片程度小于10%的胚胎;D3優(yōu)質(zhì)胚胎率=D3優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/正常受精卵裂胚胎數(shù)×100%。D3可利用胚胎:受精后D3可移植和冷凍的胚胎總和;D3可利用胚胎率=D3可利用胚胎數(shù)/卵裂胚胎數(shù)×100%。臨床妊娠的判斷:D3移植1~2枚可利用胚胎,同時給予黃體支持,移植后14 d檢測血清HCG,30 d后B超檢查可見孕囊者診斷為臨床妊娠;臨床妊娠率=臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)。

    三、統(tǒng)計學分析

    結(jié) 果

    一、精子純化效果

    顯微鏡下觀察染色后的精子,并未見圓形細胞或胞質(zhì)殘余體(圖1),證明所檢測到的mRNA是成熟精子中的mRNA。

    優(yōu)選后的精子用0.4%伊紅Y染色30 min后顯微鏡下觀察,未見圓形細胞和殘余體圖1 顯微鏡下精子純化效果(×400)

    二、不同活力精子的CatSper2表達水平比較

    精液正常組46例(41.1%)和少弱精子組66例(58.9%)的基礎(chǔ)資料比較無顯著性差異(P>0.05)。精液正常組和少弱精子組前向運動精子百分率分別為(55.7±8.23)%和(24.9±5.62)%,有顯著性差異(P<0.05);精液正常組的CatSper2表達水平[(1.26±0.23)]顯著高于少弱精子組[(0.54±0.18)](P<0.05)。分析發(fā)現(xiàn),前向運動精子百分率和CatSper2基因的相對表達量呈顯著性正相關(guān)(r=0.416,P<0.05)(圖2)。

    圖2 前向運動精子百分率與CatSper2 mRNA相對表達量的相關(guān)性

    三、不同濃度精子CatSper2的表達水平比較

    高濃度組和低濃度組的基礎(chǔ)資料比較無顯著性差異(P>0.05)。高濃度組的CatSper2表達水平為(0.89±0.27),低濃度組為(0.80±0.20),組間比較無顯著性差異(P>0.05)。精子不同濃度與CatSper2表達水平相關(guān)性并不顯著(r=0.024,P>0.05)。

    四、不同受精情況的CatSper2表達水平比較

    A、B、C三組間的基礎(chǔ)資料比較無顯著性差異(P>0.05)。A、B、C三組CatSper2的相對表達量分別為(0.98±0.05)、(1.00±0.06)及(1.01±0.06),組間比較無顯著性差異(P>0.05)(圖3)。受精率與CatSper2的相對表達量相關(guān)性不顯著(r=0.085,P>0.05)(圖4)。

    圖3 不同受精率分組的CatSper2表達水平比較

    圖4 受精率與CatSper2 mRNA相對表達量的相關(guān)性

    五、不同胚胎質(zhì)量CatSper2表達水平比較

    Q1、Q2、Q3與Q4組的基礎(chǔ)資料比較均無顯著性差異(P>0.05)。Q1和Q2組CatSper2的相對表達量分別為(0.93±0.07)和(0.90±0.07),組間比較無顯著性差異(P>0.05)(表2);優(yōu)質(zhì)胚胎率與CatSper2的相對表達量相關(guān)性不顯著(r=0.096,P>0.05)。Q3和Q4組CatSper2的相對表達量分別為(0.88±0.12)和(0.92±0.11),組間比較無顯著性差異(P>0.05)(表2);可利用胚胎率與CatSper2的相對表達量相關(guān)性亦不顯著(r=0.028,P>0.05)。

    表2 不同胚胎質(zhì)量CatSper2的表達水平(-±s)

    六、不同妊娠情況的CatSper2表達水平比較

    所有研究對象共112個移植周期,其中新鮮移植104個周期(早期流產(chǎn)6個周期)。臨床妊娠42例(40.4%,42/104);未妊娠者56例(53.8%,56/104)。臨床妊娠組和未妊娠組的基礎(chǔ)資料比較無顯著性差異(P>0.05)。臨床妊娠組的CatSper2相對表達量為(1.00±0.05),未妊娠組為(0.98±0.09),組間比較無顯著性差異(P>0.05)。妊娠情況與CatSper2表達水平相關(guān)性不明顯(r=0.032,P>0.05)。

    討 論

    近年來大多研究報道了CatSper1與弱精子癥及男性不育的關(guān)系[11-13],CatSper2的研究尚少,且都著重于研究CatSper2在與睪丸及精子中的功能及定位等方面[14],僅有較少的國外學者曾研究CatSper2的表達水平與男性不育的關(guān)系[7],目前還未有國內(nèi)的學者研究CatSper2的表達水平與助孕妊娠結(jié)局的關(guān)系。本實驗采用逆轉(zhuǎn)錄 PCR的方法檢測精液正常組和少弱精子組的CatSper2基因的表達情況,進一步確認CatSper2與男性不育的關(guān)系。結(jié)果表明少弱精子癥患者CatSper2的表達明顯低于精液正常組,這個結(jié)果與Avidan等[15]2003年發(fā)現(xiàn)CatSper2基因缺失導致弱畸精子的研究結(jié)果相一致。李紅鋼等[16]通過檢測同一份標本中高、低活力的精子CatSper2和CatSper3的mRNA水平,實驗結(jié)果表明CatSper2和CatSper3檢測可考慮作為男性不育,尤其是弱精子癥病因檢查的靶點。本實驗結(jié)果表明不同精子濃度間的CatSper2表達無顯著性差異,也進一步證實CatSper2可能是弱精子癥的相關(guān)靶基因,與Bhilawadikar等[17]的研究相一致。由于弱精子癥患者的精子中CatSper2表達下降,我們猜想CatSper2可能與精子的活力相關(guān),這與目前的研究結(jié)果相一致。

    本研究嘗試分析CatSper2與輔助生殖過程中相關(guān)指標的相關(guān)性,如果CatSper2與受精率、胚胎質(zhì)量和妊娠有一定的相關(guān)性,則其可能作為一項預測IVF結(jié)局的危險因素,將CatSper2作為改善IVF不佳結(jié)局的一個可能性的靶點。通過進一步研究CatSper2導致精子活力降低的原因,可能通過提高CatSper2在精子中的表達從而改善IVF的不佳結(jié)局。遺憾的是,本實驗結(jié)果表明CatSper2只與活力有相關(guān)性,與受精率、胚胎質(zhì)量和妊娠并無相關(guān)性(P>0.05)。一項回顧性的研究表明,與正常精子比較,活力差的精子授精后其輔助生殖助孕的結(jié)局不佳[117]。Correia等[18]的研究結(jié)果表明,CatSper2在精子超活化等方面發(fā)揮重要的作用,但不是一個發(fā)育性標志。Quill等[19]研究表明CatSper敲除的精子尾部無“鞭打”運動,基本無前向運動。由此可知,CatSper的作用在于使精子穿透卵母細胞外殼,而對卵母細胞激活和精卵融合無意義。Bhilawadikar等[17]的研究結(jié)果與本研究一致,結(jié)論為CatSper2與精子活力相關(guān),而與受精率、胚胎質(zhì)量的相關(guān)性不明顯。

    綜上所述,CatSper2與精子活力相關(guān),而與精子濃度、受精率、胚胎質(zhì)量及妊娠結(jié)局的相關(guān)性并不明顯,提示其對助孕治療妊娠結(jié)局的預測意義不大。但是由于受到研究數(shù)量的限制,研究結(jié)果可能存在一定偏差。后續(xù)需要進一步擴大研究對象,做更深層次的研究,為輔助生殖的不良結(jié)局尋找新的解決方案和治療途徑。

    猜你喜歡
    受精率精液精子
    種蛋受精率檢查的重要性和結(jié)果解釋
    提高種鵝受精率的幾項關(guān)鍵措施
    豬人工授精精液采集、處理和保存方法
    牛冷凍精液的制作、保存和解凍方法
    精子求偶記
    產(chǎn)蛋周齡對科寶父母代肉種雞受精率及孵化效果的影響
    廣東飼料(2016年3期)2016-12-01 03:43:11
    公兔精液冷凍保存技術(shù)
    精子DNA完整性損傷的發(fā)生機制及診斷治療
    精液長時間冷凍儲存與冷凍復蘇率的相關(guān)性研究
    不同水平維生素E對雞受精率和孵化率的影響
    国产色婷婷99| 99国产精品免费福利视频| 91久久精品国产一区二区三区| 国产精品国产av在线观看| 最近手机中文字幕大全| 99热国产这里只有精品6| 97超碰精品成人国产| 一级黄片播放器| 国产精品三级大全| 久久免费观看电影| 亚洲经典国产精华液单| 午夜视频国产福利| 亚洲人成网站在线观看播放| 久久鲁丝午夜福利片| 18禁动态无遮挡网站| 国产成人精品婷婷| 三级国产精品欧美在线观看| 精品一品国产午夜福利视频| 精品人妻熟女av久视频| 日韩大片免费观看网站| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 乱码一卡2卡4卡精品| 亚洲高清免费不卡视频| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲精品自拍成人| 国产精品不卡视频一区二区| 国产69精品久久久久777片| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久国产精品麻豆| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久午夜福利片| 多毛熟女@视频| av播播在线观看一区| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | av国产久精品久网站免费入址| 亚州av有码| 男的添女的下面高潮视频| 久久av网站| 97在线人人人人妻| 老司机影院成人| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 亚洲成人手机| 中国三级夫妇交换| 在线观看免费日韩欧美大片 | 一区二区av电影网| 亚洲av成人精品一二三区| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产伦精品一区二区三区四那| 老熟女久久久| 亚洲av不卡在线观看| 国产69精品久久久久777片| a 毛片基地| 最后的刺客免费高清国语| 国产免费视频播放在线视频| 免费av中文字幕在线| 各种免费的搞黄视频| 又大又黄又爽视频免费| 黄片无遮挡物在线观看| 色94色欧美一区二区| av有码第一页| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产色婷婷99| 中文资源天堂在线| 国产男女超爽视频在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产又色又爽无遮挡免| av视频免费观看在线观看| 欧美97在线视频| 国产色婷婷99| 三上悠亚av全集在线观看 | 高清毛片免费看| 久久久久久人妻| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲综合色惰| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产欧美亚洲国产| 免费看光身美女| 欧美+日韩+精品| 日韩一区二区视频免费看| 黄色欧美视频在线观看| 国产高清三级在线| av黄色大香蕉| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲国产精品国产精品| av黄色大香蕉| 丝袜喷水一区| 99久久人妻综合| 久久精品国产a三级三级三级| av线在线观看网站| 综合色丁香网| 一级a做视频免费观看| 亚洲内射少妇av| 九色成人免费人妻av| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲自偷自拍三级| 一本色道久久久久久精品综合| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品偷伦视频观看了| 国产真实伦视频高清在线观看| 久久久午夜欧美精品| 国产免费福利视频在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲成色77777| 国产在线免费精品| 久久久久久久久久成人| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 一级毛片aaaaaa免费看小| 精品亚洲成a人片在线观看| 乱人伦中国视频| 中文字幕制服av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 嘟嘟电影网在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 精品少妇内射三级| 久久青草综合色| 一级毛片电影观看| 午夜激情久久久久久久| 视频区图区小说| 日本色播在线视频| av免费观看日本| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美最新免费一区二区三区| 精品酒店卫生间| av有码第一页| www.av在线官网国产| 欧美激情国产日韩精品一区| 免费看不卡的av| 国产色爽女视频免费观看| av在线app专区| 久久精品国产a三级三级三级| 自线自在国产av| 亚洲成人一二三区av| 极品教师在线视频| 秋霞在线观看毛片| 99热6这里只有精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 日本欧美国产在线视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 精品卡一卡二卡四卡免费| 六月丁香七月| 日日摸夜夜添夜夜爱| 国产综合精华液| 亚洲情色 制服丝袜| 97在线视频观看| 国产精品欧美亚洲77777| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日韩大片免费观看网站| 七月丁香在线播放| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产亚洲欧美精品永久| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 2018国产大陆天天弄谢| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲av成人精品一二三区| 搡女人真爽免费视频火全软件| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 精华霜和精华液先用哪个| 全区人妻精品视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲av欧美aⅴ国产| 中文天堂在线官网| 亚洲成色77777| 精品熟女少妇av免费看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 永久免费av网站大全| 免费高清在线观看视频在线观看| 最黄视频免费看| 七月丁香在线播放| 久久久久视频综合| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 搡老乐熟女国产| 亚洲情色 制服丝袜| 天堂8中文在线网| 日本爱情动作片www.在线观看| av国产精品久久久久影院| 亚洲综合精品二区| 免费黄色在线免费观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 麻豆成人午夜福利视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 亚洲成人一二三区av| 午夜精品国产一区二区电影| 国产高清三级在线| 午夜视频国产福利| 久久久国产精品麻豆| 丝袜在线中文字幕| 另类精品久久| 在线观看人妻少妇| 久久这里有精品视频免费| 亚洲性久久影院| 国产免费福利视频在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 免费观看a级毛片全部| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 在线观看三级黄色| 国国产精品蜜臀av免费| 观看美女的网站| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲精品第二区| av黄色大香蕉| 人妻 亚洲 视频| 亚洲性久久影院| 久久久国产精品麻豆| 天堂中文最新版在线下载| 日日啪夜夜撸| 日本色播在线视频| 99热网站在线观看| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 国产又色又爽无遮挡免| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 五月开心婷婷网| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日韩制服骚丝袜av| 激情五月婷婷亚洲| 午夜福利影视在线免费观看| 日韩一区二区三区影片| 十八禁高潮呻吟视频 | 黑人高潮一二区| 最近中文字幕高清免费大全6| av不卡在线播放| 亚洲精品国产av蜜桃| 午夜影院在线不卡| 国产精品.久久久| 亚洲av中文av极速乱| 久久久久视频综合| av在线播放精品| 国产美女午夜福利| 亚洲国产成人一精品久久久| 一个人免费看片子| 久久精品久久久久久久性| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产精品国产av在线观看| 伦理电影大哥的女人| 在线看a的网站| 亚洲综合色惰| 久久影院123| 亚洲精品国产av成人精品| 久久久久久久国产电影| 两个人免费观看高清视频 | 一本色道久久久久久精品综合| 久久ye,这里只有精品| 亚洲国产最新在线播放| 最近的中文字幕免费完整| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 十八禁网站网址无遮挡 | 婷婷色av中文字幕| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 五月天丁香电影| 老女人水多毛片| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 成人影院久久| 香蕉精品网在线| 久久久国产精品麻豆| 色吧在线观看| 久久国内精品自在自线图片| 夜夜爽夜夜爽视频| 成人毛片60女人毛片免费| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 水蜜桃什么品种好| 国产深夜福利视频在线观看| 成年人免费黄色播放视频 | 久久午夜综合久久蜜桃| 少妇熟女欧美另类| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 亚洲性久久影院| 国产精品久久久久久精品古装| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久久久久久久久久久大奶| a级毛片免费高清观看在线播放| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 国产av一区二区精品久久| 在线观看av片永久免费下载| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲精品乱久久久久久| 18禁在线播放成人免费| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 免费看av在线观看网站| av在线app专区| 夜夜爽夜夜爽视频| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 成人无遮挡网站| 我要看黄色一级片免费的| 午夜激情福利司机影院| 一级黄片播放器| 内地一区二区视频在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 国产精品伦人一区二区| 成年av动漫网址| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 人人妻人人看人人澡| 国产成人精品福利久久| 91久久精品电影网| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 国内精品宾馆在线| 欧美一级a爱片免费观看看| 波野结衣二区三区在线| 人人妻人人澡人人看| 一二三四中文在线观看免费高清| 婷婷色av中文字幕| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 国产黄频视频在线观看| 欧美性感艳星| 久久精品国产亚洲网站| 蜜桃在线观看..| 日韩av在线免费看完整版不卡| 一级片'在线观看视频| 99久久精品国产国产毛片| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 久久久久精品性色| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 午夜91福利影院| 少妇精品久久久久久久| 街头女战士在线观看网站| 老司机亚洲免费影院| 日韩成人伦理影院| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 春色校园在线视频观看| 中文字幕久久专区| 街头女战士在线观看网站| 国产黄片视频在线免费观看| 少妇精品久久久久久久| 日韩欧美 国产精品| 亚洲av男天堂| 国产 精品1| 少妇精品久久久久久久| 高清黄色对白视频在线免费看 | 成人美女网站在线观看视频| 高清黄色对白视频在线免费看 | 亚洲三级黄色毛片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲不卡免费看| 亚洲欧美精品自产自拍| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲无线观看免费| 蜜臀久久99精品久久宅男| av国产精品久久久久影院| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 欧美精品一区二区大全| 在线观看美女被高潮喷水网站| 亚洲图色成人| 全区人妻精品视频| 男女边吃奶边做爰视频| 日本黄色片子视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 极品人妻少妇av视频| 国产精品熟女久久久久浪| 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品国产三级专区第一集| 综合色丁香网| 国产91av在线免费观看| 波野结衣二区三区在线| 777米奇影视久久| a 毛片基地| 国产在线免费精品| 最黄视频免费看| 国模一区二区三区四区视频| 一级爰片在线观看| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 嫩草影院新地址| 日韩视频在线欧美| 午夜日本视频在线| 毛片一级片免费看久久久久| 十八禁高潮呻吟视频 | 99九九在线精品视频 | 久久精品久久久久久噜噜老黄| 一区二区三区四区激情视频| 新久久久久国产一级毛片| 亚洲av日韩在线播放| 激情五月婷婷亚洲| 特大巨黑吊av在线直播| av天堂中文字幕网| 97在线视频观看| 日韩一区二区三区影片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 国产极品粉嫩免费观看在线 | 九色成人免费人妻av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 午夜日本视频在线| 精品国产国语对白av| 欧美+日韩+精品| 一边亲一边摸免费视频| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲精品视频女| 天美传媒精品一区二区| 又爽又黄a免费视频| 国产av精品麻豆| 夫妻午夜视频| 丝袜在线中文字幕| 国产高清不卡午夜福利| 亚洲av.av天堂| 水蜜桃什么品种好| 日本黄色日本黄色录像| 国产男人的电影天堂91| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲,欧美,日韩| 99久久精品热视频| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 乱码一卡2卡4卡精品| 日韩av不卡免费在线播放| 一区二区三区免费毛片| 赤兔流量卡办理| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| av免费在线看不卡| 曰老女人黄片| 免费看光身美女| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丰满饥渴人妻一区二区三| av天堂中文字幕网| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 久久精品久久久久久久性| 欧美最新免费一区二区三区| 一级片'在线观看视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 久久鲁丝午夜福利片| www.色视频.com| 久久国内精品自在自线图片| 蜜桃在线观看..| 国内揄拍国产精品人妻在线| 色婷婷久久久亚洲欧美| 内射极品少妇av片p| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 人体艺术视频欧美日本| 国产精品欧美亚洲77777| 三上悠亚av全集在线观看 | 国产精品久久久久成人av| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 一级二级三级毛片免费看| av在线app专区| 街头女战士在线观看网站| 国产精品久久久久成人av| 精品酒店卫生间| 久久久久人妻精品一区果冻| tube8黄色片| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产精品嫩草影院av在线观看| 色网站视频免费| 中国国产av一级| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日韩中字成人| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 黄色怎么调成土黄色| 99久国产av精品国产电影| 免费看光身美女| 午夜久久久在线观看| 成年av动漫网址| 亚洲av国产av综合av卡| 免费观看的影片在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 久久97久久精品| h视频一区二区三区| 久久精品国产自在天天线| 黄色视频在线播放观看不卡| 午夜激情福利司机影院| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲精品视频女| 久久99热这里只频精品6学生| 国产精品久久久久久久久免| 国产免费福利视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 欧美高清成人免费视频www| 久久久久久伊人网av| 在线观看www视频免费| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 国产高清有码在线观看视频| 美女中出高潮动态图| 久久久久久久久大av| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产综合精华液| 欧美高清成人免费视频www| 五月玫瑰六月丁香| 国产一级毛片在线| 男的添女的下面高潮视频| videossex国产| a级片在线免费高清观看视频| xxx大片免费视频| 亚洲人成网站在线播| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久久久网色| 全区人妻精品视频| 天美传媒精品一区二区| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久国产精品大桥未久av | 国产色婷婷99| 少妇丰满av| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产精品免费大片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久99精品国语久久久| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 老司机影院毛片| 久久综合国产亚洲精品| 中文字幕久久专区| 日本vs欧美在线观看视频 | 男女啪啪激烈高潮av片| 一级毛片我不卡| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 免费少妇av软件| 亚洲av男天堂| 久久精品国产a三级三级三级| 69精品国产乱码久久久| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产免费一级a男人的天堂| 国模一区二区三区四区视频| 丁香六月天网| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 午夜福利影视在线免费观看| h视频一区二区三区| 亚洲av成人精品一二三区| 免费黄网站久久成人精品| av免费观看日本| 色视频www国产| 亚洲国产精品专区欧美| 国产精品99久久99久久久不卡 | 嘟嘟电影网在线观看| 亚洲精品视频女| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产免费福利视频在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久久国产精品麻豆| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 97超碰精品成人国产| 丰满迷人的少妇在线观看| av视频免费观看在线观看| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲三级黄色毛片| 日韩中文字幕视频在线看片| 中文在线观看免费www的网站| 97超视频在线观看视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 十分钟在线观看高清视频www | 午夜福利网站1000一区二区三区| 亚洲欧美一区二区三区国产| 男女啪啪激烈高潮av片| 在线免费观看不下载黄p国产| 精品人妻偷拍中文字幕| 五月天丁香电影| 永久免费av网站大全| 简卡轻食公司| 亚洲av日韩在线播放| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产av码专区亚洲av| 国模一区二区三区四区视频| 人体艺术视频欧美日本| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产高清不卡午夜福利| 久久6这里有精品| 不卡视频在线观看欧美| 久久综合国产亚洲精品| 在线精品无人区一区二区三| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 人人妻人人看人人澡| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲无线观看免费| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 蜜桃在线观看..| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲自偷自拍三级| 夜夜爽夜夜爽视频| 2018国产大陆天天弄谢| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 亚洲高清免费不卡视频| av天堂中文字幕网| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 欧美区成人在线视频| 美女内射精品一级片tv| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 在线观看国产h片| 人妻一区二区av| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 久久久精品免费免费高清| 青春草亚洲视频在线观看| 国产毛片在线视频| 国产免费视频播放在线视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 男男h啪啪无遮挡| 欧美最新免费一区二区三区| 精品国产国语对白av| 全区人妻精品视频| 在现免费观看毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费在线观看成人毛片| 只有这里有精品99| 丝袜在线中文字幕| 精品国产乱码久久久久久小说| 久久久久久人妻|