自制與原研消旋卡多曲顆粒體外溶出度的對(duì)比研究

王 芳，宋 莉，郭 琪，于 亮，劉玉黔，梁大連**

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2. 青島市婦女兒童醫(yī)院，山東 青島266071）

消旋卡多曲（thiorphan，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）是由法國(guó)Bioprojet公司開(kāi)發(fā)的一種特異性的腦啡肽酶抑制劑，可延長(zhǎng)內(nèi)源性腦啡肽的抗分泌作用[1]，是目前唯一的抗分泌藥。臨床作為口服補(bǔ)液或靜脈補(bǔ)液的輔助治療，用于1月以上嬰兒和兒童的急性腹瀉[2]。

目前，消旋卡多曲顆粒已過(guò)專(zhuān)利保護(hù)期。在國(guó)內(nèi)，有2家藥廠生產(chǎn)，2015年版中國(guó)藥典增加了該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)比該品種2015年版中國(guó)藥典中的溶出度執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)和進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20070085的溶出條件[3]發(fā)現(xiàn)，2015年版中國(guó)藥典的溶出度執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中的色譜條件與有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定條件相同，均為梯度，而進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20070085中的溶出度測(cè)定的色譜條件與含量測(cè)定的條件相同為等度，通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HPLC測(cè)定本品的溶出度時(shí)，只有主成分，沒(méi)有干擾峰，且主藥消旋卡多曲出峰時(shí)間較短，因此進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20070085中的溶出度測(cè)定的色譜條件較簡(jiǎn)單合理。本研究根據(jù)“消旋卡多曲散進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20070085”中溶出度的測(cè)定方法結(jié)合自研制劑的性質(zhì)優(yōu)化其溶出條件，以法國(guó)Bioprojet公司生產(chǎn)的Tiorfan?作為原研制劑，采用適合本品種的4 種溶出條件進(jìn)行試驗(yàn)研究，考察自制與原研制劑樣品在4 種不同溶出介質(zhì)：2 % SDS水溶液、0.2 mol/L鹽酸溶液（pH 1.2）、pH 4.5和pH 6.8磷酸鹽緩沖液中溶出曲線的一致性，為研發(fā)出與原研藥質(zhì)量一致性的仿制藥及后續(xù)該品種的一致性評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。

圖1 消旋卡多曲的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1 儀器與材料

METTLER AE240電子天平，LC-10T 高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），ZRS-4 智能溶出儀（天津大學(xué)無(wú)線電廠）。

消旋卡多曲對(duì)照品（批號(hào)Y0000896，EP），自制品（規(guī)格10 mg，批號(hào)F20140102）， Tiorfan?（規(guī)格10 mg，批號(hào)SXN300，法國(guó)Bioprojet公司），市售消旋卡多曲顆粒（規(guī)格10 mg，批號(hào)120911，四川百利藥業(yè)）。磷酸二氫鉀、十二烷基硫酸鈉、磷酸氫二鉀、（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、鹽酸（天津大茂化學(xué)制劑廠），純凈水（杭州娃哈哈公司），甲醇（山東禹王），乙腈（美國(guó)Fisher 公司）。

2 溶出度測(cè)定方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo BDS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：水-乙腈-甲醇（體積比40:38:22）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：231 nm；進(jìn)樣量：20 μl；柱溫：30 ℃。

2.2 溶液配制

對(duì)照溶液：精密稱(chēng)取消旋卡多曲對(duì)照品25.23 mg，置入25 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置入100 ml量瓶，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，得對(duì)照溶液。

供試品溶液：量取經(jīng)脫氣處理的溶出介質(zhì)2.0 % SDS 1000 ml，置溶出杯內(nèi)，開(kāi)啟溶出儀使槳板轉(zhuǎn)速穩(wěn)定在75 r/min，待溶出介質(zhì)溫度恒定在（37±0.5）℃后，取供試品1袋，投入溶出杯內(nèi)，記時(shí)；在60 min取溶液濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

空白輔料溶液：取除消旋卡多曲以外處方量的其他輔料，按消旋卡多曲制備工藝制成不含消旋卡多曲的陰性制劑。同供試溶液制備項(xiàng)下操作，得空白輔料溶液。

2.3 溶出度測(cè)定法

取樣品12袋，采用溶出度測(cè)定法（中國(guó)藥典2015 年版四部溶出度與釋放度測(cè)定）第二法（槳法）的裝置，以水1000 ml （含2 % SDS）為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為75 r/min，依法操作，分別在5，10，15，20，30，45 和60 min取溶液10 ml，同時(shí)補(bǔ)液10 ml，濾過(guò)，續(xù)濾液作為供試品溶液。另取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液。分別精密量取供試品溶液與對(duì)照品溶液20 μl注入色譜儀，記錄色譜圖。計(jì)算每袋在不同時(shí)間的累計(jì)溶出量。

3 方法與結(jié)果

3.1 溶出度測(cè)定驗(yàn)證（溶出介質(zhì)：2.0% SDS水溶液）

圖2 消旋卡多曲的HPLC 色譜圖

3.1.1 專(zhuān)屬性考察 分別取溶出介質(zhì)、2.2項(xiàng)下的空白輔料溶液、對(duì)照溶液和供試溶液各20 μl注入液相色譜儀，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果表明，輔料和溶出介質(zhì)對(duì)消旋卡多曲出峰無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.1.2 線性與范圍 精密稱(chēng)取消旋卡多曲對(duì)照品25.23 mg，置入25 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；然后精密移取1 ml置入10 ml量瓶，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，作為貯備液；分別精密移取貯備液0.1，0.25，0.5，0.7，1.0，1.2 ml置入10 ml量瓶，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取20 μl注入液相色譜儀，分別在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以峰面積A為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A=13.628C+2.6515，相關(guān)系數(shù)r=0.9999，結(jié)果表明，消旋卡多曲對(duì)照品在1.01～12.11 mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取2.2項(xiàng)下的消旋卡多曲對(duì)照溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得消旋卡多曲峰面積RSD為1.6 %（n= 6），結(jié)果表明，色譜系統(tǒng)重復(fù)性良好。

3.1.4 中間精密度試驗(yàn) 取自研制劑（批號(hào)：F20140102）6袋，改變分析設(shè)備，按2.3項(xiàng)下溶出度測(cè)定法操作，60 min時(shí)取樣，濾過(guò)，精密量取各續(xù)濾液20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計(jì)算溶出度RSD為1.5 %，表明本法中間精密度良好。

3.1.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取溶出條件下60 min溶出液，過(guò)濾后，取續(xù)濾液作為供試品溶液，在不同時(shí)間進(jìn)樣，記錄色譜圖。另取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液進(jìn)樣。結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，本品溶出液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.1.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 按處方量空白輔料9 份，分別精密加入消旋卡多曲對(duì)照品（5，7 和10 mg），依照2.2項(xiàng)下供試品溶液的處理方法制備各3 份樣品，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄峰面積，測(cè)得消旋卡多曲的平均回收率為100.3 %，RSD為0.7 %（n=9），結(jié)果表明，方法準(zhǔn)確度良好。

3.1.7 色譜條件變化 取2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，在確定的色譜條件基礎(chǔ)上，考察分別改變流動(dòng)相比例、流速、柱溫、檢測(cè)波長(zhǎng)及色譜柱對(duì)測(cè)定的影響。結(jié)果見(jiàn)表2，由表2可知色譜條件有微小變化時(shí)，測(cè)定不受影響，表明此方法耐用性良好。

表2 色譜條件變化

3.2 市售及原研制劑溶出度比較

取市售消旋卡多曲顆粒及原研制劑，分別使用2015年版中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)、進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20070085和自研標(biāo)準(zhǔn)的溶出條件（見(jiàn)表3），按2.3項(xiàng)下溶出度測(cè)定法操作。結(jié)果見(jiàn)圖3，兩者在相同的溶出條件下溶出行為不相似（f2因子＜50）。

表3 消旋卡多曲顆粒溶出度檢查方法對(duì)比

圖3 市售制劑和原研制劑不同溶出度檢查方法的溶出曲線對(duì)比

3.3 溶出曲線測(cè)定和對(duì)比結(jié)果

3.3.1 自制與原研制劑對(duì)比 取自制和原研樣品各12袋，按2.3項(xiàng)下溶出度測(cè)定法操作，分別各樣品，在2.0 % SDS 、0.2 mol/L鹽酸溶液（pH 1.2）、pH 4.5和pH 6.8磷酸鹽緩沖液1000 ml 為溶出介質(zhì)中的溶出曲線，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算溶出質(zhì)量濃度；根據(jù)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)12 袋的平均累積釋放量（%）分別繪制自制和原研制劑的溶出曲線，見(jiàn)圖4。根據(jù)《普通口服固體制劑溶出度實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[4]，采用f2相似因子評(píng)價(jià)自制與原研制劑溶出曲線的相似性[5-10]，根據(jù)文獻(xiàn)[11]中相似因子f2的公式計(jì)算?自制和原研消旋卡多曲顆粒的f2值，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，在2 % SDS水溶液、0.2 mol/L鹽酸溶液（pH1.2）、pH 4.5和pH 6.8的磷酸鹽緩沖液中，相似因子f2均在50～100 內(nèi)，表明自制和原研消旋卡多曲顆粒在不同介質(zhì)中的溶出行為一致。

圖4 自制消旋卡多曲顆粒和原研消旋卡多曲顆粒在4 種溶出介質(zhì)中的溶出曲線

表4 自制和原研消旋卡多曲顆粒溶出曲線相似性分析結(jié)果

3.3.2 在不同溶出介質(zhì)下溶出曲線對(duì)比 分別取原研及自制制劑，按2.3項(xiàng)下溶出度測(cè)定法操作，分別使用0.5 % SDS、1.0 % SDS、2.0 % SDS 3種不同溶出介質(zhì)測(cè)定兩者的溶出曲線，并采用相似性f2因子法評(píng)價(jià)不同溶出介質(zhì)下自制與原研制劑溶出曲線的相似性。結(jié)果見(jiàn)圖5。溶出介質(zhì)為0.5 % SDS、1.0 %SDS、2.0 % SDS時(shí)，f2分別為66，68，76。表明不同溶出介質(zhì)下自制與原研制劑的溶出行為相似（f2＞50）。但本品在0.5 %和1.0 % SDS中溶出過(guò)慢，區(qū)分能力不高，相比之下2.0 % SDS中溶出比較快，區(qū)分能力也比較強(qiáng)，與國(guó)外市售對(duì)照制劑溶出曲線的相似度較好。

3.3.3 在不同轉(zhuǎn)速下溶出曲線對(duì)比 分別取原研及自制制劑，按2.3項(xiàng)下溶出度測(cè)定法操作，分別使用50，75，100 r/min 3種不同轉(zhuǎn)速測(cè)定兩者的溶出曲線，并采用相似性f2因子法評(píng)價(jià)不同轉(zhuǎn)速下自制與原研制劑溶出曲線的相似性。結(jié)果見(jiàn)圖5。轉(zhuǎn)速為50，75，100 r/min時(shí)，f2分別為53，64，61。表明不同轉(zhuǎn)速下自制與原研制劑的溶出行為相似（f2＞50）。

圖5 自制與原研制劑不同溶出介質(zhì)和轉(zhuǎn)速下溶出曲線對(duì)比

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)自研標(biāo)準(zhǔn)中的溶出條件的測(cè)定方法進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，結(jié)果表明，該方法專(zhuān)屬性、耐用性均良好，適合本品的溶出度測(cè)定。市售與原研制劑（Tiorfan?）無(wú)論用2015年版中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)、或進(jìn)口藥品注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)JX20070085及自研標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，溶出曲線均不一致（f2＜50），兩者體內(nèi)生物利用度不一致的概率也將高達(dá)90%[12]。自制與原研制劑樣品溶出曲線對(duì)比試驗(yàn)研究可見(jiàn)，自制與原研制劑在4 種不同溶出介質(zhì)中的溶出曲線相似，在不同轉(zhuǎn)速下也相似，提示自制與原研制劑體外溶出行為一致，表明自制制劑處方合理、樣品質(zhì)量穩(wěn)定可靠。依據(jù)新的藥品研發(fā)標(biāo)準(zhǔn)和要求，對(duì)自制制劑做了上述研究，結(jié)果表明，自制消旋卡多曲顆粒與原研制劑 “質(zhì)量一致”。本試驗(yàn)也為本品以后將要進(jìn)行的一致性評(píng)價(jià)及人體生物等效性試驗(yàn)提供了參考依據(jù)。