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    shRNA干擾腎癌細(xì)胞株786-O和 OS-RC-2中 HIF-2α的表達(dá)對(duì)VEGF的影響

    2018-09-17 06:45:38鞏進(jìn)偉段建敏盧建中楊寧強(qiáng)王培龍趙永錄張效通張正潮范康武李朝明
    衛(wèi)生職業(yè)教育 2018年17期
    關(guān)鍵詞:常氧低氧質(zhì)粒

    鞏進(jìn)偉 ,段建敏 ,盧建中 ,李 燁 ,楊寧強(qiáng) ,王培龍 ,趙永錄 ,張效通 ,張正潮 ,范康武 ,李朝明

    (1.隴南市第一人民醫(yī)院,甘肅 隴南 746000;2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院,甘肅 蘭州730030)

    腎細(xì)胞腎癌(renal cell carcinoma,RCC)是我國(guó)泌尿系統(tǒng)常見(jiàn)惡性腫瘤之一,多起源于腎實(shí)質(zhì)泌尿小管上皮系統(tǒng),故又稱腎腺癌(簡(jiǎn)稱腎癌)。大多數(shù)患者早期缺乏特異性的臨床表現(xiàn),就診時(shí)多出現(xiàn)轉(zhuǎn)移,這也是腎癌患者死亡的主要原因。流行病學(xué)研究顯示,RCC病死率約為40%,明顯高于膀胱癌及前列腺癌,其發(fā)病機(jī)制至今未明確。據(jù)統(tǒng)計(jì)[1],2013年,美國(guó)有65 150例RCC患者得以確診,13 680例患者死亡。確診病例中,腎細(xì)胞癌占92%,腎盂癌占6%,腎母細(xì)胞瘤占1%。2005—2009年,腎癌患者數(shù)量以每年3.1%的速度增加,死亡率則以0.5%的速度下降,而我國(guó)以每年2.5%的速度遞增,20%~30%的病例就診時(shí)已出現(xiàn)擴(kuò)散或轉(zhuǎn)移,手術(shù)治療后仍出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者占20%~40%[2]。20世紀(jì)50年代,腫瘤低氧概念在放射治療實(shí)體腫瘤失敗的病因研究中被提出,組織低氧是人類多種實(shí)體腫瘤的病理特征,實(shí)體腫瘤不能徹底通過(guò)放療和化療等手段根治,往往是由于瘤體存在適應(yīng)低氧環(huán)境的腫瘤細(xì)胞。因此,腫瘤低氧靶基因的靶向治療成為研究的焦點(diǎn)。低氧誘導(dǎo)因子系統(tǒng)的激活與人類RCC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。研究資料表明[2-3],低氧誘導(dǎo)因子 -2α(hypoxia inducible factors-2α,HIF-2α)降解可抑制腫瘤生長(zhǎng),是影響腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因。近年來(lái),腎細(xì)胞癌的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移被認(rèn)為取決于血管生成。低氧誘導(dǎo)因子(HIFs)是一種缺氧應(yīng)答調(diào)控因子,能誘導(dǎo)腫瘤血管生成血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)。VEGF 促進(jìn)血管新生,為腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)。本研究中,我們討論在腎透明細(xì)胞癌(CCRCC)細(xì)胞株中運(yùn)用RNA干擾技術(shù)特異性引起低氧誘導(dǎo)因子-2α基因干擾,觀察常氧和低氧環(huán)境下低氧誘導(dǎo)因子-2αmRNA的表達(dá)及其下游基因VEGF的表達(dá)情況。

    1 試劑與方法

    1.1 主要試劑

    786-O和OS-RC-2細(xì)胞株由蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿研究所提供,DH5α感受態(tài)細(xì)胞盒購(gòu)自北京天根公司,HIF-2α單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,VEGF-A購(gòu)自Bioworld technology公司,鼠抗兔購(gòu)自中杉金橋公司,質(zhì)粒抽提試劑盒和Trizol購(gòu)自生工公司,胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclon公司,CoCl2購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,LipofectamineTM 2000和VybrantTMApoptosis Assay Kit購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司,反轉(zhuǎn)錄試劑5X primeScriptRT Master Mix和Real Time PCR試劑SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)購(gòu)自TakaRa公司。

    1.2 HIF-2αshRNA設(shè)計(jì)及載體質(zhì)粒構(gòu)建、轉(zhuǎn)化提取

    根據(jù)NCBI提供的HIF-2α(NM_001430.3)的mRNA序列,應(yīng)用Ambion公司提供在線設(shè)計(jì)siRNA工具,選擇4條候選干擾片段。分別設(shè)計(jì)合成發(fā)卡樣兩端反向互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸序列(見(jiàn)表1),同時(shí)合成互補(bǔ)鏈(反義鏈),其中正義鏈5’端引入BamHⅠ酶切位點(diǎn),反義鏈5’端引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn),該重組質(zhì)粒由廣州復(fù)能公司合成。以空載體質(zhì)粒作為陰性對(duì)照。shRNA干擾組:合成質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,37℃輕搖培養(yǎng)1 h,取菌液接種于含50 μg/ml氨芐青霉素LB培養(yǎng)平板37℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑取陽(yáng)性單克隆進(jìn)行擴(kuò)增,按試劑盒說(shuō)明書(shū)小量抽提DNA。

    表1 免疫印跡法分析RNA干擾對(duì)786-O細(xì)胞和OS-RC-2細(xì)胞中VEGF 蛋白表達(dá)的影響(±s)

    表1 免疫印跡法分析RNA干擾對(duì)786-O細(xì)胞和OS-RC-2細(xì)胞中VEGF 蛋白表達(dá)的影響(±s)

    注:N:空白對(duì)照常氧組;Nc:陰性對(duì)照常氧組;Ni:重組質(zhì)粒常氧組;H:低氧組;Hc:陰性對(duì)照低氧組;Hi:重組質(zhì)粒低氧組

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    1.3 細(xì)胞培養(yǎng),轉(zhuǎn)染細(xì)胞

    786-O和OS-RC-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%的胎牛血清,青、鏈霉素100 u/ml的RPMI1640培養(yǎng)基中。轉(zhuǎn)染前一天,按每孔3×105~5×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于2 ml不含抗生素培養(yǎng)基的6孔板中,轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞可長(zhǎng)至90%~95%融合。分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,6 h后換培養(yǎng)基,常氧環(huán)境即細(xì)胞在含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。低氧環(huán)境模擬則用含150 μmol/L CoCl2的10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

    1.4 Real time-PCR法檢測(cè)常氧和低氧環(huán)境下HIF-2αmRNA表達(dá)

    空白對(duì)照組不做轉(zhuǎn)染,陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒,實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染shRNA。48 h后提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,繼而Real time-PCR 反應(yīng)體系 SYBR?Premix Ex TaqTM II 2X 10 μl,引物各0.8 μl(上游引物:5′CATgCgCTAgACTCCgAgAACA3′,下游引物:3′gCTTTgCGAgCATCCggTA5′),用 GAPDH 作為內(nèi)參照進(jìn)行半定量(GAPDH 序列 1:5′gCACCgTCAAggCTGAGAAC3′;序列2:5′TGGTGAAGACGCCAGTGGA3′)cDNA 溶液 2 μl,補(bǔ)雙蒸水至20 μl。每個(gè)樣本同時(shí)設(shè)立3個(gè)平行管,每次反應(yīng)均進(jìn)行溶解曲線分析,以證實(shí)無(wú)特異性擴(kuò)增。反應(yīng)完成后,ΔΔct法分析HIF-2αmRNA表達(dá)量,菌液送Takara公司測(cè)序鑒定。

    1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

    利用AnnexinV-PI雙染色進(jìn)行早期細(xì)胞凋亡檢測(cè),脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48 h后,收集對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞,預(yù)冷PBS清洗,離心,棄上清液,分別加入 5 μl AnnexinV-FITC 和 5 μl PI,重懸后室溫避光孵育15 min,上機(jī)檢測(cè)。

    1.6 Western Blot檢測(cè)VEGF蛋白水平變化

    脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞72 h后收集細(xì)胞,提取蛋白,BCA法563 nm處檢測(cè)吸光度值,做標(biāo)準(zhǔn)曲線后計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離,轉(zhuǎn)印PVDF膜,用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h,分別加入1∶1 000稀釋的VEGF-A兔單抗和1∶1 000稀釋的GAPDH單抗,4℃孵育過(guò)夜。TBST洗滌,加入1∶1 000稀釋的二抗孵育,最后避光滴加ECL發(fā)光試劑,染色1 min后曝光分析,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,計(jì)算各樣本灰度值與GAPDH內(nèi)參灰度值比值,了解蛋白水平變化。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較應(yīng)用方差分析,P<0.05表示有顯著性差異。

    2 結(jié)果

    2.1 shRNA對(duì)HIF-2αmRNA的表達(dá)及鑒定

    采用Real time-PCR方法,以GAPDH為基因內(nèi)參照,分析shRNA對(duì) HIF-2αmRNA表達(dá)的影響,采用 ΔΔct法分析HIF-2αmRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,shRNA的抑制率可達(dá)64.0%,與對(duì)照組差異顯著(P=0.007)。將shRNA質(zhì)粒送Takara公司測(cè)序(引物 5′CATgCgCTAgACTCCgAgAACA3),序列完全正確(見(jiàn)圖1)。

    圖1 HIF-2αshRNA真核表達(dá)載體質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

    2.2 shRNA在常氧和低氧環(huán)境下對(duì)HIF-2αmRNA表達(dá)的抑制

    采用Real time-PCR方法檢測(cè)48 h后轉(zhuǎn)染細(xì)胞HIF-2αmRNA表達(dá)情況,擴(kuò)增曲線中ct值提示有良好的線性關(guān)系,溶解曲線未見(jiàn)雜峰,表明引物特異性高。定量分析結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組在常氧環(huán)境下,786-O和OS-RC-2兩種細(xì)胞中HIF-2αmRNA表達(dá)抑制率分別為61.5%(P=0.021)與72.3%(P=0.030),有顯著性差異。對(duì)照組786-O細(xì)胞在低氧環(huán)境下較常氧環(huán)境下HIF-2αmRNA表達(dá)量增高,說(shuō)明在低氧環(huán)境下HIF-2αmRNA表達(dá)更為活躍(P=0.04)(見(jiàn)圖 2)。OS-RC-2細(xì)胞中 HIF-2αm-RNA的表達(dá)量無(wú)明顯變化(見(jiàn)圖3)。

    圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)786-O細(xì)胞中HIF-2αmRNA表達(dá)水平

    圖3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)OS-RC-2細(xì)胞中HIF-2αmRNA表達(dá)水平

    2.3 流式細(xì)胞儀測(cè)定分析細(xì)胞凋亡

    流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:HIF-2α干擾可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。我們檢測(cè)到,與空載體組比較,實(shí)驗(yàn)組786-O和OS-RC-2細(xì)胞中HIF-2α基因在低氧狀態(tài)下凋亡率升高,在常氧狀態(tài)下沒(méi)有明顯的早期凋亡。說(shuō)明在基因沉默且低氧條件下早期凋亡率會(huì)升高,分別為14.1%(見(jiàn)圖4)和5.0%(見(jiàn)圖5)。

    圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)786-O細(xì)胞凋亡

    圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)OS-RC-2細(xì)胞凋亡

    2.4 shRNA抑制HIF-2α基因后VEGF蛋白的變化

    采用Quantity one軟件進(jìn)行灰度值分析,數(shù)據(jù)以SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理,計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示(見(jiàn)表1),72 h后檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞VEGF蛋白表達(dá)量(見(jiàn)圖6、7)。陰性對(duì)照組中低氧與常氧狀態(tài)下786-O和OS-RC-2細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)分別增加了 28.3%(P=0.037)、27.0%(P=0.029)。實(shí)驗(yàn)組常氧環(huán)境下以上兩種細(xì)胞VEGF蛋白水平分別下降了55.4%(P=0.001)、54.7%(P=0.001),低氧環(huán)境分別下降了 28.3%(P=0.026)、48.4%(P=0.001)。分析結(jié)果顯示:CoCl2誘導(dǎo)低氧可以促進(jìn)兩種細(xì)胞中VEGF蛋白的表達(dá)。HIF-2αshRNA可明顯抑制CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)VEGF。

    3 討論

    3.1 HIF-2α和VEGF的結(jié)構(gòu)與功能

    圖6 Western Blot檢測(cè)786-O細(xì)胞中VEGF的表達(dá)

    圖7 Western Blot檢測(cè)在OS-RC-2細(xì)胞中VEGF的表達(dá)

    HIF-2α在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá),在RCC的發(fā)病機(jī)制中HIF-2α的作用得到深入研究。HIFs屬于轉(zhuǎn)錄因子家族,是由一個(gè)不穩(wěn)定的 α 亞基(HIF-1α,HIF-2α,HIF-3α)和穩(wěn)定的 β 亞基(芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子)組成的異二聚物功能轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。HIF-2α為HIF族內(nèi)因子,是由HIF-2α和HIF-1β亞基組成的異源二聚體,又稱內(nèi)皮PAS蛋白-1(EPAS-1)HLF。HRF和MOP2定位于染色體2p16-21,兩者均為螺旋-環(huán)-螺旋(basic-helix-loop-helix,bHLH)PAS(Per/ARNT/Sim)結(jié)構(gòu)蛋白族內(nèi)成員,基本結(jié)構(gòu)包括PAS結(jié)構(gòu)域、bHLH結(jié)構(gòu)域、反式活化結(jié)構(gòu)域及入核信號(hào)。HIF-2是腫瘤耐受低氧環(huán)境的標(biāo)志物,主要由HIF-2α和HIF-1β兩個(gè)亞單位構(gòu)成。α和β亞基構(gòu)成了具有轉(zhuǎn)錄活性的異源二聚體。α亞基受氧濃度調(diào)節(jié),表達(dá)不穩(wěn)定,β亞基是結(jié)構(gòu)性亞基,因非依賴性氧降解而在胞核內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)。人類腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移依賴血管形成,新生血管的形成受以酪氨酸激酶受體(RTKs)為靶點(diǎn)的特異生長(zhǎng)因子調(diào)控。VEGF和Flk/KDR RTK被認(rèn)為是多種信號(hào)通路特異性血管內(nèi)皮細(xì)胞因子的關(guān)鍵因子,包括實(shí)體腫瘤血管生成的途徑或生理性血管的形成過(guò)程。抑制VEGF酪氨酸激酶信號(hào)通路可以阻斷生長(zhǎng)期腫瘤的血管形成,從而使腫瘤停止生長(zhǎng)甚至退化。目前有大量促血管生成的因子及與之同源的受體被發(fā)現(xiàn),VEGF最具代表性,它在生長(zhǎng)因子中比較獨(dú)特,尤其是在血管內(nèi)皮特異性功能方面。目前已知VEGF因子包含VEGF、胎盤生長(zhǎng)因子、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及VEGF-E,這些分子都具有典型的規(guī)則間隔的模序,由8半胱氨酸殘基(稱為半胱氨酸結(jié))組成,以二聚體糖蛋白的方式分泌內(nèi)因子。這類糖蛋白屬于一種生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)的超級(jí)家族,包括PDGF-BB和TGF-β2。目前發(fā)現(xiàn)3種VEGF高度親和同源內(nèi)皮細(xì)胞受體:VEGFR-1/Flt-1、VEGFR-2/Flk/KDR和VEGFR-3/Flt-4,這些受體作為信號(hào)分子發(fā)揮著重要作用。胚胎發(fā)育過(guò)程中,位于內(nèi)皮細(xì)胞的VEGFR-1和VEGFR-2作為細(xì)胞表面的酪氨酸激酶受體(RTKs),參與VEGF及其受體基因協(xié)調(diào)表達(dá)的模式證實(shí)其參與了胚胎發(fā)育時(shí)生理性血管形成過(guò)程。

    3.2 腫瘤細(xì)胞中HIF-2α誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)

    作為已知最具潛能的、直接發(fā)揮作用的血管生成因子蛋白,VEGF是一種可彌散的內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原、血管生成因子,可以增加血管通透性,在多種體內(nèi)模型誘導(dǎo)顯著的血管生成反應(yīng)。在新生血管中,殘存的內(nèi)皮細(xì)胞具有VEGF依賴性[4]。目前認(rèn)為,銀屑病、黃斑變性、腫瘤生長(zhǎng)等狀況下體內(nèi)病理性血管形成是由VEGF產(chǎn)生過(guò)多引起[5],培養(yǎng)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化也會(huì)引起VEGF表達(dá)。Kieser等[6]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),基因突變引起小鼠腫瘤抑癌基因p53和VEGF mRNA表達(dá)。毛細(xì)血管由既往存在的血管芽生式的過(guò)程被稱為血管形成,該過(guò)程受數(shù)量眾多的促血管形成和抗血管形成因子調(diào)控。腫瘤細(xì)胞不斷需要新的血管來(lái)滋養(yǎng)其生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移。因此,腫瘤血管化是一個(gè)新生物由小的局限的腫瘤進(jìn)展為大的腫物并形成轉(zhuǎn)移能力的重要過(guò)程。腫瘤血管化可以分為兩個(gè)時(shí)期:血管化前期(也稱血管形成的開(kāi)關(guān)期)及血管化期[7]。一旦腫瘤細(xì)胞進(jìn)入向血管化的轉(zhuǎn)化過(guò)程,便可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞及其他類型細(xì)胞表型發(fā)生變化。此時(shí),無(wú)血管的腫瘤可以擁有血液供應(yīng),這意味著腫瘤生長(zhǎng)速度加快,而無(wú)法血管化的腫瘤便會(huì)壞死或者細(xì)胞凋亡,完成血管化的腫瘤不僅進(jìn)入快速生長(zhǎng)期,而且其轉(zhuǎn)移能力也顯著增強(qiáng)。VEGF及其受體已被證實(shí)與許多實(shí)體腫瘤的血管形成關(guān)系密切。如肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、胃癌和前列腺癌。HIF-2α是腫瘤耐受低氧微環(huán)境生長(zhǎng)的標(biāo)志因子,目前已證實(shí)HIF-2α基因參與腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展。HIF-2α在腫瘤侵襲網(wǎng)絡(luò)機(jī)制中處于上游位置,可促進(jìn)下游VEGF表達(dá),常氧環(huán)境下VEGF呈低水平表達(dá),主要作用是維持血管密度。CoCl2應(yīng)用于體外模擬細(xì)胞低氧環(huán)境,與二價(jià)鈷離子可誘導(dǎo)細(xì)胞中HIF及其他相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)有關(guān)。由于二價(jià)鈷離子可以置換PHD輔助因子等價(jià)鐵離子阻止HIF-α被羥基化,同時(shí)影響pVHL結(jié)合HIF-αODD,因此,CoCl2可穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)HIF-α表達(dá),鈷原卟啉與氧的親和力較差,可以脫氧狀態(tài)封閉傳感器使細(xì)胞缺氧,VEGF基因表達(dá)上調(diào)[7],模擬腫瘤低氧環(huán)境。

    3.3 不同環(huán)境下兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率及轉(zhuǎn)染后HIF-2αmRNA的表達(dá)量

    shRNA在細(xì)胞中的抑制率明顯優(yōu)于siRNA分子的表達(dá)沉默效應(yīng),很多研究證實(shí)shRNA可以通過(guò)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的載體質(zhì)粒,篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株后通過(guò)整合包裝成反轉(zhuǎn)錄病毒或慢病毒載體,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能夠穩(wěn)定地抑制靶基因表達(dá)。本研究中,shRNA的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染786-O和OS-RC-2細(xì)胞,特異性干擾HIF-2α表達(dá),觀察其對(duì)以上兩種細(xì)胞的抑制效應(yīng)。HIF-2α表達(dá)質(zhì)粒對(duì)786-O和OS-RC-2細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率分別為42.0%和38.0%,轉(zhuǎn)染48 h后可觀察到顯著變化。786-O細(xì)胞在常氧環(huán)境下抑制率為61.5%,與陰性對(duì)照組相比差異有顯著性(P=0.021)。實(shí)驗(yàn)組低氧較常氧環(huán)境下HIF-2αmRNA的表達(dá)量增高,表明在低氧環(huán)境下,HIF-2αmRNA 表達(dá)更為活躍,差異顯著(P=0.04)。OS-RC-2細(xì)胞的抑制率為72.3%,與陰性對(duì)照組相比差異有顯著性(P=0.030)。實(shí)驗(yàn)組在低氧環(huán)境下較常氧環(huán)境下HIF-2αmRNA的表達(dá)量無(wú)明顯變化。原因可能為受脂質(zhì)體或質(zhì)粒毒性導(dǎo)致細(xì)胞中HIF-2αmRNA表達(dá)量無(wú)明顯差異。我們利用流式細(xì)胞儀觀察到,陰性對(duì)照組在常氧環(huán)境下沉默HIF-2α基因,并沒(méi)有引起786-O和OS-RC-2細(xì)胞凋亡,而低氧環(huán)境使細(xì)胞凋亡加快,說(shuō)明在低氧環(huán)境下HIF不能發(fā)揮作用,不能滿足細(xì)胞的正常生理活動(dòng),導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。沉默HIF-2α基因后,786-O和OS-RC-2細(xì)胞凋亡率分別為14.1%、5.0%,原因可能是在常氧環(huán)境下,HIF-2α在沉默的情況下不能發(fā)揮作用,類似于在常氧環(huán)境下,HIF-2α自然的降解。然而,低氧環(huán)境下,HIF-2α細(xì)胞表達(dá)需要適應(yīng)低氧誘導(dǎo)基因。Semenza等[8]認(rèn)為低氧主要通過(guò)激活VEGF轉(zhuǎn)錄、提高VEGFmRNA穩(wěn)定性上調(diào)VEGF表達(dá),從而促進(jìn)血管新生。對(duì)一些正?;蛘咿D(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行低氧處理后,VEGFmRNA的表達(dá)能力很快被可逆性地誘導(dǎo)出來(lái)。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),HIF-2α和VEGF在正常膀胱組織中高表達(dá),而在膀胱癌組織中表達(dá)較強(qiáng),且兩者的表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)和臨床分期密切相關(guān)。此外,HIF-2α表達(dá)與VEGF表達(dá)還呈正相關(guān)[9]。

    3.4 不同環(huán)境下兩種細(xì)胞VEGF的表達(dá)量

    我們從蛋白免疫印跡結(jié)果中發(fā)現(xiàn),低氧環(huán)境下VEGF蛋白超表達(dá),即使沉默了HIF-2αmRNA的表達(dá),低氧較常氧環(huán)境下VEGF蛋白表達(dá)水平仍較高,進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞處于低氧環(huán)境下,HIF-2α仍可促進(jìn)VEGF相關(guān)受體表達(dá),使VEGF基因表達(dá),VEGF蛋白增多。常氧環(huán)境下,利用α-酮戊二酸和鐵作為輔因子,PHD羥基化HIF-2α中兩個(gè)保守的脯氨酸殘基(pro405,pro531),導(dǎo)致HIF-2α聚泛素化而被26 s蛋白酶體降解。實(shí)驗(yàn)組VEGF基因有明顯的抑制作用,72 h后利用蛋白免疫印跡方法測(cè)得786-O和OS-RC-2細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)在常氧環(huán)境下分別下降了54.5%、52.8%,在低氧環(huán)境下下降了27.6%、49.9%,證明HIF-2α基因可以調(diào)控VEGF基因表達(dá)。本研究結(jié)果表明,shRNA表達(dá)載體質(zhì)粒構(gòu)建成功,抑制下游基因VEGF,使VEGF蛋白表達(dá)量下降。由Peng等制作的一個(gè)獨(dú)立的HIF-2α基因敲除模型中,在突變小鼠的卵黃囊和胚胎中可以觀察到血管缺陷,來(lái)自純合的HIF-2α敲入的胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)生長(zhǎng)加快和在異種移植試驗(yàn)中血管生成現(xiàn)象[10]。

    目前,血管生成抑制劑已應(yīng)用于臨床,作為靶向藥物治療晚期腎癌獲得國(guó)內(nèi)外學(xué)者的一致認(rèn)可,但是此類藥物會(huì)產(chǎn)生一些不良反應(yīng),包括高血壓、皮膚毒性(皮疹、手足綜合征)、胃腸道反應(yīng)(厭食、惡心、嘔吐和腹瀉)、肝功能損害以及血液毒性(中性粒細(xì)胞、血小板減少癥)、乏力等,而其是否對(duì)血管完整性造成影響還需進(jìn)一步臨床觀察。

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