黃芪注射劑對糖尿病腎病小鼠腎臟脂聯(lián)素表達(dá)影響的研究*

王 松，房 芳，魯 冰，籍胤璽，付莉萍

河南省南陽市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科(南陽 473009)

主題詞 糖尿病腎病/中西醫(yī)結(jié)合療法 @黃芪注射劑 小鼠

糖尿病是常見的一種疾病，而糖尿病腎病是糖尿病的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，且發(fā)病率呈不斷上升趨勢[1]。糖尿病腎病病理特征主要為細(xì)胞外基質(zhì)積聚、系膜增生、基底膜增厚及腎小球肥大等[2]。糖尿病腎病是造成終末期腎功能不全的一個主要病因，臨床延緩以及治療糖尿病腎病病程的進(jìn)展較為困難[3-5]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病腎病病機(jī)屬本虛標(biāo)實(shí)，隨著中醫(yī)藥的不斷深入研究，廣泛應(yīng)用于臨床，且取得良好效果。黃芪是一種扶正補(bǔ)氣中藥，其成分主要為黃芪皂苷、黃芪多糖、黃芪黃酮等[6]。近年來研究報道顯示黃芪注射液用于糖尿病腎病取得良好效果。脂聯(lián)素是一種近年來新發(fā)現(xiàn)的脂肪因子，具有胰島素增敏、抗動脈粥樣硬化及抗炎作用等[7]。本研究旨在探討黃芪注射劑對糖尿病腎病小鼠腎臟脂聯(lián)素表達(dá)的影響，為本病研究提供參考。

材料與方法

1 材 料 SPF級C57BL/6小鼠80只，體質(zhì)量(20±2)g，武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCkx(閩)2011-0002。主要試劑：小鼠脂聯(lián)素試劑盒(上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)，PAS染色試劑盒(上海里奇生物科技有限公司)，鏈脲佐菌素(北京索萊寶科技有限公司)主要儀器：日本日立7600型全自動生化分析儀，美國強(qiáng)生血糖儀，日本Olympus光學(xué)顯微鏡。

2 方 法

2.1 造模方法：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，給予高脂飼料喂養(yǎng)(膽酸鹽1%、膽固醇2.5%、蔗糖20%、豬油10%、基礎(chǔ)飼料66.5%)。于6周后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素80 mg/kg誘發(fā)高血糖，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，鏈脲佐菌素應(yīng)用前以0.1 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制成1%溶液。于1周后測定小鼠空腹血糖，以空腹血糖≥11.1 mmol/L的繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料6周，在12周末選取造模組小鼠80只，二氧化碳窒息處死后取出腎臟，PAS染色，大部分PAS染色示小鼠腎小球肥大且基底膜增厚，以及系膜區(qū)膨脹則視為糖尿病腎病。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組：80只小鼠隨機(jī)分為空白組(n=16)、模型組(n=16)、陽性對照組(n=16)、低劑量實(shí)驗(yàn)組(n=16)、高劑量實(shí)驗(yàn)組(n=16)。

2.3 給藥方法：空白組不給予造模，每日給予等劑量生理鹽水灌胃；模型組于造模成功后給予等劑量生理鹽水灌胃；陽性對照組給予坎地沙坦5 mg/(kg·d)灌胃；低劑量實(shí)驗(yàn)組給予1.0 mg/(kg·d)灌胃;高劑量實(shí)驗(yàn)組給予2.0 mg/(kg·d)灌胃,各組均持續(xù)8周，于8周末取腎臟組織，于-20℃下保存待測。

2.4 PCR檢測腎臟組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)：提取總RNA，采用酶標(biāo)儀測定濃度，取適量總RNA，根據(jù)試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)操作逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，由生物工程有限公司合成引物。定量PCR采取熒光定量PCR染料法，β-actin內(nèi)參引物和每個樣本脂聯(lián)素設(shè)置4個復(fù)孔，采用實(shí)時定量PCR儀分析PCR產(chǎn)物結(jié)果。

3 觀察指標(biāo) 觀察各組體重和血糖變化；觀察各組24 h尿量和24 h尿微量蛋白變化。采集24h尿量測定尿量，采用放射免疫分析法測定尿微量蛋白，尿微量蛋白試劑盒；觀察各組腎功能指標(biāo)變化，包括血肌酐和尿素氮，血肌酐試劑盒，尿素氮試劑盒。采用日立7600型全自動生化分析儀測定血肌酐和尿素氮；觀察各組腎臟組織脂聯(lián)素mRNA表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料采用例/%表示。對于兩組組間計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，對于多組計(jì)量資料采用F檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組體重和血糖變化比較 模型組、陽性對照組、低劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組體重?zé)o明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，陽性對照組、低劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組血糖降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，低劑量實(shí)驗(yàn)組血糖無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高劑量實(shí)驗(yàn)組血糖降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量實(shí)驗(yàn)組血糖低于低劑量實(shí)驗(yàn)組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組體重和血糖變化比較

注：與空白組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與低劑量實(shí)驗(yàn)組比較，□P<0.05

2 各組24 h尿量和24 h尿微量蛋白變化比較 與模型組比較，陽性對照組、低劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組24 h尿量和24 h尿微量蛋白降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與陽性對照組比較，低劑量實(shí)驗(yàn)組24 h尿量和24 h尿微量蛋白無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高劑量實(shí)驗(yàn)組24 h尿量和24 h尿微量蛋白降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量實(shí)驗(yàn)組24 h尿量和24 h尿微量蛋白低于低劑量實(shí)驗(yàn)組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組24 h尿量和24 h尿微量蛋白變化比較

注：與空白組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與低劑量實(shí)驗(yàn)組比較，□P<0.05

3 各組腎功能指標(biāo)變化比較 與模型組比較，陽性對照組、低劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組血肌酐和尿素氮降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與陽性對照組比較，低劑量實(shí)驗(yàn)組血肌酐和尿素氮無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高劑量實(shí)驗(yàn)組血肌酐和尿素氮降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量實(shí)驗(yàn)組血肌酐和尿素氮低于低劑量實(shí)驗(yàn)組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組腎功能指標(biāo)變化比較

注：與空白組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與低劑量實(shí)驗(yàn)組比較，□P<0.05

4 各組脂聯(lián)素變化比較 與模型組比較，陽性對照組、低劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組脂聯(lián)素 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與陽性對照組比較，低劑量實(shí)驗(yàn)組脂聯(lián)素 mRNA表達(dá)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高劑量實(shí)驗(yàn)組脂聯(lián)素 mRNA表達(dá)降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量實(shí)驗(yàn)組脂聯(lián)素 mRNA表達(dá)低于低劑量實(shí)驗(yàn)組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組脂聯(lián)素變化比較

注：與空白組比較，△P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與低劑量實(shí)驗(yàn)組比較，□P<0.05

討 論

流行病學(xué)調(diào)查顯示，隨著近年來人們飲食結(jié)構(gòu)的不斷變化、生活習(xí)慣的不斷改變，使得糖尿病發(fā)病率呈逐年上升趨勢，嚴(yán)重影響了人們生活質(zhì)量和身心健康[8-9]。隨著糖尿病發(fā)病率不斷上升，使得糖尿病腎病發(fā)病率也呈不斷上升趨勢[10-13]。目前，臨床上尚無有效的治療糖尿病腎病方法[14-15]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病腎病發(fā)病病機(jī)為脾失健運(yùn)、濕熱內(nèi)蘊(yùn)、津液不化，聚留為水，久病致水邪泛濫。消渴經(jīng)久不愈，血運(yùn)氣血無力，則會血瘀阻絡(luò)，陰虛、血瘀是貫穿糖尿病腎病病程的重要病機(jī)。黃芪注射液是一種純中藥制劑，現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪注射液具有抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等多種生物活性，其成分中黃芪黃酮具有抗氧化清除自由基作用，認(rèn)為其機(jī)理主要是酚羥基類基團(tuán)在與過氧化物作用時，能夠提供氫原子，從而發(fā)生氧化還原反應(yīng)而發(fā)揮作用[16-17]。此外，黃芪注射液具有擴(kuò)張腎血管、保護(hù)腎臟血管內(nèi)皮功能、增加腎血流量及減少蛋白尿作用[18]。本研究表明，與模型組比較，陽性對照組、低劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組24 h尿量和24 h尿微量蛋白降低，且高劑量實(shí)驗(yàn)組24 h尿量和24 h尿微量蛋白低于低劑量實(shí)驗(yàn)組，提示黃芪注射液可降低糖尿病腎病小鼠尿量和尿微量蛋白，且能夠改善小鼠腎功能。

長期以來，多途徑、多因素等相互作用被認(rèn)為是糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，但其具體機(jī)制尚未完全闡明，認(rèn)為糖尿病時有多種途徑造成炎癥參與糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展[19-20]。脂聯(lián)素不僅與2型糖尿病、胰島素、肥胖等相關(guān)，同時在免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21]。脂聯(lián)素與胰島素抵抗具有明顯的相關(guān)性。目前，大部分學(xué)者認(rèn)為胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷貫穿于2型糖尿病發(fā)生、發(fā)展的始終。而胰島素抵抗、高胰島素血癥經(jīng)多種途徑會引起對腎臟組織損傷[22]。有研究報道顯示，2型糖尿病患者脂聯(lián)素水平明顯上升，且隨著糖尿病的進(jìn)程不斷發(fā)展，可能會導(dǎo)致更多的糖尿病腎病發(fā)生，且脂聯(lián)素水平與糖尿病腎功能受損程度和病程成正相關(guān)[23]。由此可知，脂聯(lián)素是脂肪組織分泌的具有抗氧化、抗炎、抗動脈硬化以及改善胰島素抵抗作用，脂聯(lián)素與心腦血管疾病、糖尿病、糖尿病腎病及肥胖等有相關(guān)性，故而認(rèn)為脂聯(lián)素可能是防治糖尿病腎病的一個新靶點(diǎn)[24-25]。本研究表明，與模型組比較，陽性對照組、低劑量實(shí)驗(yàn)組和高劑量實(shí)驗(yàn)組脂聯(lián)素 mRNA表達(dá)降低，且高劑量實(shí)驗(yàn)組脂聯(lián)素 mRNA表達(dá)低于低劑量實(shí)驗(yàn)組，提示黃芪注射液可降低腎臟脂聯(lián)素表達(dá)。

綜上所述，黃芪注射劑可降低糖尿病腎病小鼠腎臟脂聯(lián)素表達(dá)，且可改善腎功能降低血糖，具有重要研究價值。但本文研究還存在一些不足，如納入觀察動物相對較少，還需在后續(xù)中增加觀察動物，為進(jìn)一步研究，提供可靠參考價值。