枸杞葉黃酮提取物對復合羊肉糜脂肪酸的影響研究

陳瑾,韓麗娜，韓夢佳，范艷麗

(寧夏大學 農(nóng)學院，銀川 750021)

肉類及其制品是人類飲食構(gòu)成的重要組成部分，通常肉品質(zhì)的營養(yǎng)價值用PUFA(多不飽和脂肪酸，polyunsaturated fatty acid)/SFA(飽和脂肪酸，saturated fatty acid)(P∶S)比值來衡量，美國衛(wèi)生部推薦 P∶S 應高于0.45為佳。攝入過多的飽和脂肪酸可導致動脈粥樣硬化[1]、血膽固醇升高等[2]。灘羊肉作為寧夏特產(chǎn)，脂肪分布均勻且營養(yǎng)豐富[3，4]，但其脂肪含量較高，P∶S比率較低[5]。將富含 n-3 多不飽和脂肪酸的植物油與灘羊肉制成混合羊肉糜能夠有效地提高羊肉糜的不飽和脂肪酸含量[6，7]。但脂肪酸不飽和程度相對較高，容易氧化變質(zhì)導致營養(yǎng)價值變低，因此脂肪酸抗氧化的研究至關重要。

黃酮類物質(zhì)作為天然抗氧化劑的代表[8-10]，具有抗腫瘤、抗氧化、清除自由基等作用[11-13]，被廣泛應用于食品中[14]。研究表明枸杞葉黃酮類化合物含量較高[15]，但枸杞葉多用作廉價配料，未能充分發(fā)揮其潛在價值[16,17]。本試驗以枸杞葉黃酮提取物為天然抗氧化劑，通過空白對照研究在4 ℃冷藏條件下分別于試驗第0，3，6，9，12，15天的脂肪酸相對含量變化，從而進一步揭示枸杞葉黃酮提取物的抗氧化活性，為枸杞葉的深加工利用及灘羊肉的保存提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞芽茶：銀川育新枸杞種業(yè)有限公司；羊肉、羊脂：市售寧夏灘羊肉及其脂肪；亞麻籽油(食品級)：銀川原源食品油有限公司；歐麗薇蘭橄欖油(食品級)：益海嘉里食品營銷有限公司；氯化鈉、石油醚、苯及無水硫酸鈉：均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

AL204型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 日本島津公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；JDG-0.2型真空凍干試驗機 蘭州科近真空凍干技術(shù)有限公司；Finnpipette 彩色數(shù)字移液器 美國熱電公司(Thermo Electron)。

1.3 試驗方法

1.3.1 枸杞葉黃酮化合物的制備

本試驗是采用實驗室自己制備的枸杞葉黃酮提取物進行的后續(xù)試驗[18]?，F(xiàn)將枸杞葉黃酮的提取過程稍做簡單介紹。乙醇提取黃酮類物質(zhì)的步驟如下：枸杞芽茶→粉碎→過篩→稱取粉末→加入70%乙醇提取2 h，重復2次→過濾→合并濾液→濃縮→石油醚脫脂→濃縮→冷凍干燥→黃酮類化合物。

1.3.2 復合羊肉糜的構(gòu)建

取羊背最長肌和羊脂肪以2∶1(m/m)混合，先后用絞肉機和斬拌機制成新鮮肉糜；以市購橄欖油和亞麻籽油按2∶3(m/m)混合均勻。以羊肉糜(83%)、混合油(10%)、食鹽(2%)和飲用水(5%)攪拌混勻[19]，制成復合羊肉糜。

1.3.3 試驗分組

把制成的復合羊肉糜分為2組：空白組和黃酮添加組，其中黃酮添加組在羊肉糜中添加1%枸杞葉黃酮提取物制成復合羊肉糜。所有樣品裝入保鮮密封袋中，做好標記，4 ℃條件下冷藏存放。分別于試驗第0，3，6，9，12，15天取樣測定脂肪酸相對含量。

1.3.4 脂肪酸的測定方法

1.3.4.1 脂肪提取

稱取10 g混合肉糜樣品，加入120 mL三氯甲烷-甲醇溶液(體積比為2∶1)，45 ℃恒溫振蕩2 h后過濾，向濾液中加入30 mL飽和NaCl溶液，振蕩搖勻，靜止分層，下層的三氯甲烷層即為脂肪提取液，用無水Na2SO4干燥后，在45 ℃水浴中用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得到脂肪。

1.3.4.2 脂肪酸甲酯化處理

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)測定樣品脂肪酸相對含量。取濃縮脂肪50 mg置于15 mL具塞試管中，加入2 mL苯-石油醚混合溶液(體積比為1∶1)，輕輕搖動使之溶解。再加入2 mL 0.4 mol/L KOH-甲醇溶液，混勻。加適量飽和NaCl溶液使全部有機相(甲醇溶液)升至試管上部。澄清后吸取上清液，裝入進樣小瓶中，用于GC-MS分析[20]。

1.3.4.3 氣相色譜條件

色譜柱：DB-FFAP毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；壓力100.1 kPa；總流量87.3 mL/min；柱流量1.04 mL/min；線速率38.9 cm/s；吹掃流量3.0 mL/min；分流比80∶1；進樣量1 μL；載氣為氦氣；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度160 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升到175 ℃，保持2 min，再以4 ℃/min升到185 ℃，保持2 min，最后以4 ℃/min升到230 ℃，保持3 min?？偝绦驎r間27.5 min[21]。

1.3.4.4 質(zhì)譜條件

電子電離離子源：離子源溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；溶劑延遲2 min；質(zhì)量掃描范圍40～450 m/z。

1.3.4.5 定性及定量分析

試驗采用MST11 Library譜庫相似度檢索定性及峰面積定量分析，采取峰面積歸一化法測定各脂肪酸的相對含量，僅報道匹配度大于70(最大匹配度為100)的結(jié)果。

1.3.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 第0天復合羊肉糜中脂肪酸相對含量檢測結(jié)果

通過GC-MS檢測第0天復合羊肉糜的脂肪酸種類和相對含量，復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜見圖1和圖2。

圖1 第0天空白組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.1 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 0 day

圖2 第0天黃酮添加組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.2 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for flavonoids added group at 0 day

脂肪酸種類脂肪酸相對含量(%,x±SD )空白組黃酮添加組SFA癸酸(C10∶D0)0.15±0.010.14±0.01月桂酸(C12∶D0)0.11±0.010.12±0.01肉豆蔻酸(C14∶D0)2.68±0.293.42±0.59十五烷酸(C15∶D0)0.35±0.070.47±0.09棕櫚酸(C16∶D0)17.12±2.9818.23±0.08十七烷酸(C17∶D0)1.21±0.131.56±0.27硬脂酸(C18∶D0)19.22±1.4523.30±0.32*SFA總量40.84±3.4247.24±0.44

續(xù) 表

注：“*”表示脂肪酸相對含量較空白組具有顯著差異(P<0.05)，樣本量n=3。

由表1可知，第0天，黃酮添加組與空白組復合羊肉糜中飽和脂肪酸除硬脂酸外，其余相對含量均無顯著差異(P>0.05)，不飽和脂肪酸相對含量無顯著差異(P>0.05)。

2.2 第3天復合羊肉糜中脂肪酸相對含量檢測結(jié)果

通過GC-MS檢測第3天復合羊肉糜的脂肪酸種類和相對含量，復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜見圖3和圖4。

圖3 第3天空白組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.3 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 3rd day

圖4 第3天黃酮添加組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.4 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for flavonoids added group at 3rd day

脂肪酸種類脂肪酸相對含量(%,x±SD )空白組黃酮添加組SFA癸酸(C10∶0)0.16±0.060.12±0.01月桂酸(C12∶0)0.18±0.070.13±0.01肉豆蔻酸(C14∶0)2.62±0.232.4±0.14十五烷酸(C15∶0)0.36±0.050.38±0.01棕櫚酸(C16∶0)13.46±3.8418.39±1.15十七烷酸(C17∶0)1.59±0.561.16±0.08硬脂酸(C18∶0)18.26±5.0016.79±4.99SFA總量36.63±5.2039.37±3.59PUFA棕櫚油酸(C16∶1)1.04±0.410.76±0.10亞油酸(C18∶2n6c)6.67±1.955.62±0.26十八烷二烯酸(C18∶2)0.30±0.060.34±0.04亞麻酸(C18∶3n3c)0.99±0.280.92±0.14花生四烯酸(C20∶4n6c)0.10±0.010.11±0.02*PUFA 總量9.11±2.637.76±0.27

注：“*”表示脂肪酸相對含量較空白組具有顯著差異(P<0.05)，樣本量n=3。

由表2可知，第3天，黃酮添加組與空白組復合羊肉糜中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸相對含量均無顯著性差異(P>0.05)。由此可見，復合羊肉糜在3天的冷藏過程中脂肪酸氧化進程尚未開始。

2.3 第6天復合羊肉糜中脂肪酸相對含量檢測結(jié)果

通過GC-MS檢測第6天復合羊肉糜的脂肪酸種類和相對含量，復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜見圖5和圖6。

圖5 第6天空白組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.5 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 6th day

圖6 第6天黃酮添加組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.6 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for flavonoids added group at 6th day

脂肪酸種類脂肪酸相對含量(%,x±SD )空白組黃酮添加組SFA癸酸(C10∶0)0.13±0.020.11±0.01月桂酸(C12∶0)0.14±0.010.12±0.01肉豆蔻酸(C14∶0)2.62±0.292.18±0.13十五烷酸(C15∶0)0.34±0.060.27±0.02棕櫚酸(C16∶0)16.95±1.7217.35±0.05十七烷酸(C17∶0)1.19±0.181.01±0.07硬脂酸(C18∶0)18.03±4.0416.14±6.02SFA總量39.40±4.4337.18±6.12PUFA棕櫚油酸(C16∶1)0.79±0.111.05±0.27亞油酸(C18∶2n6c)5.51±0.265.16±0.19十八烷二烯酸(C18∶2)0.29±0.030.20±0.05亞麻酸(C18∶3n3c)0.80±0.341.18±0.42花生四烯酸(C20∶4n6c)0.05±0.010.06±0.01*PUFA總量7.44±0.227.64±0.38

注：“*”表示脂肪酸相對含量較空白組具有顯著差異(P<0.05)，樣本量n=3。

由表3可知，第6天黃酮添加組與空白組復合羊肉糜中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸相對含量均無顯著性差異(P>0.05)。由此可見，復合羊肉糜在6天的冷藏過程中脂肪酸氧化進程緩慢。

2.4 第9天復合羊肉糜中脂肪酸相對含量檢測結(jié)果

通過GC-MS檢測第9天復合羊肉糜的脂肪酸種類和相對含量，復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜見圖7和圖8。

圖7 第9天空白組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.7 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 9th day

圖8 第9天黃酮添加組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.8 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for flavonoids added group at 9th day

脂肪酸種類脂肪酸相對含量(%,x±SD)空白組黃酮添加組SFA癸酸(C10∶0)0.16±0.030.13±0.00月桂酸(C12∶0)0.18±0.040.15±0.01肉豆蔻酸(C14∶0)3.24±1.082.85±0.04十五烷酸(C15∶0)0.35±0.030.41±0.02棕櫚酸(C16∶0)17.54±0.7418.02±0.10十七烷酸(C17∶0)1.58±0.561.39±0.05硬脂酸(C18∶0)14.65±6.2023.25±0.56SFA總量37.69±5.5446.20±0.50PUFA棕櫚油酸(C16∶1)1.00±0.390.89±0.07亞油酸(C18∶2n6c)7.46±2.486.21±0.18十八烷二烯酸(C18∶2)0.28±0.040.33±0.01亞麻酸(C18∶3n3c)0.80±0.081.04±0.01*花生四烯酸(C20∶4n6c)0.09±0.010.24±0.02*PUFA總量9.64±2.598.71±0.24

注：“*”表示脂肪酸相對含量較空白組具有顯著差異(P<0.05)，樣本量n=3。

由表4可知，第9天，黃酮添加組與空白組復合羊肉糜中飽和脂肪酸相對含量無顯著性差異(P>0.05)；n-3多不飽和脂肪酸中亞麻酸含量有顯著性差異(P<0.05)，黃酮添加組比空白組含量高30%；n-6多不飽和脂肪酸中花生四烯酸含量出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，黃酮添加組是空白組含量的2.67倍。

2.5 第12天復合羊肉糜中脂肪酸相對含量檢測結(jié)果

通過GC-MS檢測第12天復合羊肉糜的脂肪酸種類和相對含量，復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜見圖9和圖10。

圖9 第12天空白組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.9 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 12th day

圖10 第12天黃酮添加組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.10 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for flavonoids added group at 12th day

脂肪酸種類脂肪酸相對含量(%,x±SD )空白組黃酮添加組SFA癸酸(C10∶0)0.22±0.100.12±0.01月桂酸(C12∶0)0.13±0.010.13±0.00肉豆蔻酸(C14∶0)2.17±0.422.39±0.14十五烷酸(C15∶0)0.37±0.040.32±0.02棕櫚酸(C16∶0)12.90±4.1513.65±1.18十七烷酸(C17∶0)0.98±0.121.08±0.05硬脂酸(C18∶0)21.74±1.3222.55±0.59SFA總量38.51±5.6240.24±1.95

續(xù) 表

注：“*”表示脂肪酸相對含量較空白組具有顯著差異(P<0.05)，樣本量n=3。

由表5可知，第12天，黃酮添加組與空白組復合羊肉糜中飽和脂肪酸相對含量無顯著性差異(P>0.05)；n-6多不飽和脂肪酸中花生四烯酸含量存在顯著性差異(P<0.05)。

2.6 第15天復合羊肉糜中脂肪酸相對含量檢測結(jié)果

通過GC-MS檢測第15天復合羊肉糜的脂肪酸種類和相對含量，復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜見圖11和圖12。

圖11 第15天空白組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.11 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of minced mutton for blank group at 15th day

圖12 第15天黃酮添加組復合羊肉糜脂肪酸甲酯的GC-MS圖譜Fig.12 GC-MS spectrum of fatty acid methyl ester of mincedmutton for flavonoids added group at 15th day

脂肪酸種類脂肪酸相對含量%(x±SD )空白組黃酮添加組SFA癸酸(C10∶0)0.14±0.010.17±0.03月桂酸(C12∶0)-0.19±0.03*肉豆蔻酸(C14∶0)1.67±0.312.55±0.01*十五烷酸(C15∶0)0.28±0.010.32±0.01*棕櫚酸(C16∶0)14.37±3.7515.47±4.11十七烷酸(C17∶0)0.76±0.040.94±0.02硬脂酸(C18∶0)14.98±5.9611.65±1.52SFA總量32.21±3.7131.29±5.62PUFA棕櫚油酸(C16∶1)0.75±0.150.62±0.08亞油酸(C18∶2n6c)4.31±0.034.58±0.07*十八烷二烯酸(C18∶2)0.25±0.010.25±0.01亞麻酸(C18∶3n3c)0.86±0.080.79±0.00花生四烯酸(C20∶4n6c)-0.04±0.02*PUFA總量6.17±0.156.28±0.11

注：“*”表示脂肪酸相對含量較空白組具有顯著差異(P<0.05)，樣本量n=3。

脂肪酸氧化分為自動氧化與酶促氧化。飽和脂肪酸經(jīng)酶促氧化，產(chǎn)生的最終產(chǎn)物為酮酸和甲基酮；不飽和脂肪酸經(jīng)光照產(chǎn)生自由基，再與氧氣反應生成過氧化自由基，最終為氫過氧化物，過氧化自由基與不飽和脂肪酸反應生成的自由基與氧氣反應生成過氧化自由基。由表6可知，第15天時黃酮添加組與空白組復合羊肉糜飽和脂肪酸中月桂酸、肉豆蔻酸、十五烷酸相對含量有顯著性差異(P<0.05)；含量分別比空白組高出19%，52.69%，14.28%；n-6多不飽和脂肪酸中花生四烯酸與亞油酸含量存在顯著性差異(P<0.05)，含量分別比空白組高出6.3%，4%。由此可見，復合羊肉糜在15天的冷藏過程中脂肪酸含量存在較大變化。

綜上結(jié)果顯示：復合羊肉糜加入黃酮第9天后亞麻酸含量有顯著性差異(P<0.05)，可知黃酮的添加對n-3多不飽和脂肪酸中亞麻酸有抗氧化效果；第9，12，15天花生四烯酸含量均有顯著性差異(P<0.05)，表明黃酮對于n-6多不飽和脂肪酸中花生四烯酸的抗氧化效果明顯；飽和脂肪酸中月桂酸、十五烷酸、肉豆蔻酸含量于第15天出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)，表明黃酮的添加對其有抗氧化效果。

2.7 冷藏過程中復合羊肉糜脂肪酸相對含量的變化分析

從上述分析可以看出，隨冷藏時間延長，復合羊肉糜中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸總量在冷藏過程中均呈先上升后下降的趨勢，與?，B等人的研究結(jié)果一致[22,23]。飽和脂肪酸中主要以硬脂酸含量最多，其總含量占總脂肪酸含量的42.40%左右。多不飽和脂肪酸中，亞油酸含量在冷藏過程中均很高。且添加枸杞葉黃酮提取物的羊肉糜體系中飽和脂肪酸中的硬脂酸在第12天含量達到最高，于第15天含量開始下降；棕櫚酸在第3天含量達到最大后開始下降；n-3多不飽和脂肪酸中亞麻酸在第6天含量達到最高后呈下降趨勢；n-6多不飽和脂肪酸中花生四烯酸在第9天含量最高；而亞油酸呈直接下降趨勢?？瞻捉M中飽和脂肪酸中的肉豆蔻酸、棕櫚酸在第9天含量最高，后開始呈下降趨勢，十五烷酸、硬脂酸于第12天含量達到最高后開始下降。且黃酮添加組中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸最大含量均大于空白組。

3 結(jié)論

本文將枸杞葉黃酮提取物添加到由植物油和羊肉構(gòu)建的復合羊肉糜中，通過檢測冷藏期內(nèi)體系的脂肪酸相對含量的變化，研究枸杞葉黃酮提取物作為天然抗氧化劑對復合羊肉糜脂肪酸的影響。試驗結(jié)果表明，枸杞葉黃酮提取物對于復合羊肉糜在貯藏過程中飽和脂肪酸中的月桂酸、十五烷酸、肉豆蔻酸有抗氧化效果；n-3不飽和脂肪酸中的亞麻酸有顯著的抗氧化效果；n-6多不飽和脂肪酸中的花生四烯酸抗氧化效果顯著；且在冷藏過程中黃酮添加組脂肪酸最大含量均高于空白組；各脂肪酸含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。綜上所述，枸杞葉黃酮提取物具有顯著的脂肪酸抗氧化效果，是一種效果良好的天然抗氧化劑，具有開發(fā)利用價值。