棉花赤霉素合成酶基因在中571的差異表達研究

石建斌，王 寧，周 紅，許慶華，喬文青，嚴根土

(中國農業(yè)科學院 棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000)

赤霉素(Gibberellins，簡稱GAs)作為一種重要的植物激素，其在植物的整個生長發(fā)育周期中起調節(jié)作用，參與控制多種多樣的植物發(fā)育過程，包括種子萌發(fā)、根的生長、莖的伸長、葉片伸展、表皮毛發(fā)育、花粉管生長、花和果實的發(fā)育等[1-3]。并且植物對環(huán)境的適應性也與GA生物合成的調控有著或多或少的關系，目前通過GA矮化突變體的研究已經基本闡明了高等植物赤霉素代謝途徑[4]。赤霉素合成過程較為復雜，整個合成途徑可分為3個階段，參與其合成的關鍵酶主要包括古巴焦磷酸合成酶(Copalyl pyrophosphate synthase,CPS)、內-貝殼杉烯合成酶(Ent-kaurene synthase,KS)、內-貝殼杉烯氧化酶(Ent-kaurene oxidase,KO)、GA-2氧化酶(GA-2 oxidase)、GA-20氧化酶(GA-20 oxidase)和GA-3氧化酶(GA-3 oxidase)等[5]。自20世紀60年代起，由于水稻sd1基因和小麥Rht1基因在育種中的應用，極大地提高了世界主要糧食作物的產量，由于GAs對農作物生長發(fā)育的調控作用，其直接或間接的影響著農作物的產量和質量，最近的研究表明主要農作物的“綠色革命”都與赤霉素密切相關[6-7]。目前，在分子水平上研究赤霉素的表達調控已成為植物激素研究領域中的前沿和熱點[8-10]。實時熒光定量PCR為目前常用檢測基因表達量的方法，操作簡便，省時省力，高精確度和高靈敏度等特點，能夠檢測表達豐度較低的mRNA，已經成為基因表達量分析的首選方法[11-12]。

赤霉素在棉花上的應用包括促進棉種發(fā)芽，提高種子活性；促進莖葉伸長，增加棉株高度；促進花芽分化，刺激花粉萌發(fā)及花粉管伸長，防止蕾鈴脫落，并促進果實生長；膨大棉鈴，增加庫容量，有利于提高單鈴質量等。研究赤霉素合成途徑相關酶基因在棉花中的時空表達模式，有助于對赤霉素的合理應用，以及進行株型改良研究。因此，本研究以陸地棉品種“中571”為材料，采用實時熒光定量PCR方法，分析在不同生長發(fā)育階段內不同組織間的赤霉素合成途徑關鍵酶基因的表達情況，為進一步了解棉花株型發(fā)育中赤霉素的表達模式提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

“中571”(Z571)由中國農業(yè)科學院棉花研究所提供，為本課題培育的常規(guī)品種。

主要儀器包括超凈工作臺，微量移液槍(Eppendorf)，iQ5實時熒光PCR儀(Bio-Rad)，高速冷凍離心機，PCR儀，水平凝膠電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)。

主要試劑包括2×SYBR Green I Mix(Takara)，96孔PCR板(Takara)，RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒、Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、RNase-Free DNase I、10×buffer、dNTP、Taq聚合酶均購自天根生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料準備 取Z571種子，在播種期種植于中國農業(yè)科學院棉花研究所東場九區(qū)試驗田。分別于幼苗期(8片真葉)、開花期、吐絮期取植株的根、莖、葉部位組織，-80 ℃保存。

1.2.2 棉花總RNA提取與質量檢測 取保存的各樣品，提取RNA。室內稱取棉花各組織樣品材料0.5 g在液氮中迅速研磨成粉末，按植物總RNA提取試劑盒說明書操作進行，提取的RNA用核酸測定儀測定濃度和純度，并用12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 反轉錄合成cDNA鏈 以提取的RNA為模版，進行逆轉錄反應，體系為20 μL，包含Total RNA 30 ng、5×g DNA Buffer 2 μL、RNase-Free ddH2O補足20 μL，混勻并簡短離心，在PCR儀中進行42 ℃ 3 min，4 ℃ 2 min。之后在體系中加入FQ-RT Primer Mix 2 μL、10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL和RNase-Free ddH2O 5 μL，混勻后置于PCR儀中進行42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min，取出后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 引物的設計 植物中參與赤霉素合成途徑的關鍵酶主要包括CPS1、KS、KO、GA2ox、GA20ox和GA3ox，以及赤霉素受體基因GID1，經在NCBI查找EST序列并參考水稻、葡萄、番茄等植物赤霉素代謝關鍵酶基因序列[13-15]，利用Primer Premier 5在各基因保守序列內設計特異性引物，以棉花內源持家基因UBQ7(GenBank：DQ116441)作為內參基因[16]，所有引物由上海生物工程公司合成(表1)。

表1 引物序列表

1.2.5 qRT-PCR分析 以反轉合成的各樣品cDNA為模版，用各目的基因的特異性引物進行Real-timePCR擴增。反應中，分別擴增不同生長階段各材料樣品中根、莖、葉組織內的各目的基因和內參基因，每樣設3重復。反應體系為20 μL，包含10 μL 2×SYBR Green I，引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應程序為95 ℃ 15 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40 times，熔解曲線的測定均是從65 ℃到95 ℃，每0.5 ℃/5 s測定吸光值1次。數(shù)據(jù)由iQ5熒光定量PCR儀全程采集、分析，用2-(△△CT)法計算目的基因表達量。

2 結果與分析

2.1 Z571棉花植株取樣與Real-time PCR

在田間分別于幼苗期，開花期和吐絮期采集棉花植株的根、莖、葉組織，用蒸餾水沖洗干凈，經吸水紙吸干多余水分后，-80 ℃保存?？俁NA的提取參照RNA提取試劑盒說明書操作進行，經12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA，條帶清晰無降解，可用于下一步的反轉錄實驗和熒光定量實驗(圖1)。

a:幼苗期；b:開花期；c:吐絮期；M:Marker；1～3:幼苗期根莖葉組織RNA；4～7:開花期根莖葉花組織RNA；8～10:吐絮期根莖葉組織RNAa:seedling；b:full-blooming；c:boll opening；M:Marker；1-3:RNA of root,stem,leaf in seedling stage；4-7:RNA of root,stem,leaf,flower in full-blooming stage；8-10:RNA of root,stem,leaf in boll opening stage圖1 中571生長發(fā)育與RNA檢測Fig.1 The growth and development of Z571and RNA detection

第一鏈cDNA的合成參照反轉錄試劑盒操作進行，并以合成的cDNA為模版，利用特異性引物對Z571材料的根、莖、葉組織內赤霉素合成途徑各關鍵酶基因進行實時熒光檢測，如圖2所示，各目的基因及內參基因的擴增曲線表現(xiàn)較好，由于目的基因不同，熔解曲線為多峰，但同一目的基因的熔解曲線表現(xiàn)為單峰，擴增產物特異性好，擴增曲線中的熒光值能夠準確反應目的產物的擴增，可以進行基因相對表達量的計算。

a:各目的基因擴增曲線；b:內參基因(UBQ7)擴增曲線；c:各目的基因熔解曲線；d:內參基因(UBQ7)熔解曲線a:amplification curve of target gene；b:amplification curve of UBQ7；c:melt curve of target gene；d:melt curve of UBQ7圖2 實時熒光定量PCR擴增曲線Fig.2 Real-time PCR amplification curve

基因Gene組織Tissue幼苗期 SeedlingΔCT=-ΔΔCT=CT(Target)-CT(UBQ7)ΔCT(Root)-ΔCT2-ΔΔCT開花期 Full-bloomingΔCT=-ΔΔCT=CT(Target)-CT(UBQ7)ΔCT(Root)-ΔCT2-ΔΔCT吐絮期 Boll openingΔCT=-ΔΔCT=CT(Target)-CT(UBQ7)ΔCT(Root)-ΔCT2-ΔΔCTCPS1根Root11.230.001.0010.081.152.2211.030.201.15莖Stem9.321.913.759.831.402.6511.42-0.190.88葉Leaf13.91-2.680.1611.95-0.720.6110.011.222.33花Flower12.76-1.530.35KS根Root7.500.001.006.990.501.426.860.641.55莖Stem8.22-0.730.606.570.931.907.370.131.09葉Leaf12.85-5.360.0210.97-3.480.097.140.361.28花Flower10.13-2.630.16KO根Root6.810.001.006.570.241.187.53-0.720.61莖Stem7.33-0.520.706.000.811.757.22-0.410.75葉Leaf8.29-1.490.367.52-0.720.616.080.731.65花Flower7.96-1.150.45GA2ox1根Root3.840.001.002.001.853.591.372.475.55莖Stem6.04-2.200.222.161.683.211.672.174.51葉Leaf4.91-1.060.482.391.462.753.420.421.34花Flower2.111.733.32GA3ox1根Root12.520.001.0010.911.603.0411.261.262.39莖Stem10.611.913.7510.372.154.4410.571.953.86葉Leaf9.712.817.028.034.4922.449.842.686.40花Flower8.593.9315.23GA20ox1根Root15.250.001.0013.771.492.8015.000.251.19莖Stem13.731.532.8810.814.4521.7913.062.194.58葉Leaf16.03-0.770.5914.600.651.5712.812.445.44花Flower9.935.3340.15GID1B根Root5.950.001.003.802.154.446.01-0.060.96莖Stem5.340.601.524.821.132.195.520.431.35葉Leaf6.30-0.350.784.041.913.763.832.124.34花Flower0.815.1435.25

棉花材料Z571在不同生長階段內的CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA3ox1、GA20ox1和GID1B基因的表達量采用2-ΔΔCT法，以棉花內源基因UBQ7為參考基因，以幼苗期Z571根組織為對照樣品進行計算，結果如表2所示。

2.2 GAs合成相關酶基因在幼苗期的表達分析

由圖3可以看出，以幼苗期Z571根組織內各目的基因的表達為對照，赤霉素合成途徑各關鍵酶基因在Z571莖、葉組織內的表達量各不相同。在Z571莖中，CPS1、GA3ox1和GA20ox1的表達量較高，表達量分別為3.75、3.75和2.88，KS、KO和GA2ox1表達量較低，其中GA2ox1最低，表達量為0.22；在Z571葉中，GA3ox1表達量升高，為7.02，其它基因表達量均低于對照。GID1B作為赤霉素受體基因，在莖組織中與GA3ox1、GA20ox1基因表達呈正相關。綜合來看，CPS1、GA20ox1和GID1B在莖中表達量較高，在葉組織中表達量較低，GA3ox1在莖葉中表達量均高于對照，KS、KO和GA2ox1在莖葉組織內表達量均低于對照水平，不同組織間基因表達量差異均達顯著水平(P<0.05)。苗期棉花植株生長速率較快，需要充足的養(yǎng)分與激素來滿足與調節(jié)植株的生長發(fā)育，該期間主要以根的生長與莖的伸長為主，需要后期階段GA3-氧化酶與GA20-氧化酶促進活性GAs的合成。

2.3 GAs合成相關酶基因在開花期的表達分析

開花期內棉花植株各組織中的GAs相關基因表達量如圖4，根組織中，各目的基因的表達量與苗期相比均有不同程度的上調，表達量在1.18～4.44，其中GA3ox1和GA20ox1分別為3.04和2.80，GID1B為4.44，GA2ox1基因表達量為3.59，以上差異均達極顯著水平(P<0.01)。莖組織中，各目的基因表達量也均表現(xiàn)為上調，為1.75～21.79，其中GA20ox1基因表達量最大，為21.79，其次為GA3ox1的4.44，差異均達極顯著水平(P<0.01)。葉組織中，GA2ox1、GA3ox1、GA20ox1和GID1B基因表達量較對照水平有所上調，分別為2.75、22.44、1.57和3.75，其中以GA3ox1基因表達量上調明顯，其余基因均表現(xiàn)為下調。花組織中，GA3ox1、GA20ox1、GID1B基因表達量高于對照且達極顯著水平(P<0.01)，分別為15.23、40.15和35.25，推測GA3ox1和GA20ox1基因的表達與花器官的形成有關。

圖3 幼苗期GAs合成途徑各關鍵酶基因在棉花各組織內的表達情況Fig.3 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton tissues in seedling stage

圖4 開花期GAs合成途徑各關鍵酶基因在棉花各組織內的表達情況Fig.4 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton tissues in full-blooming stage

2.4 GAs合成相關酶基因在吐絮期的表達分析

棉花植株生長發(fā)育后期，各組織內GAs相關基因表達如圖5所示，此階段內各目的基因表達量變化較大，根組織中GA2ox1和GA3ox1基因表達量顯著上調，分別為5.55和2.39，與對照相比差異達顯著水平(P<0.05)，其余基因表現(xiàn)不明顯。莖組織中，CPS1、KO基因表達量為下調，其余基因表達量均上調，其中以GA2ox1上調幅度最大，為4.51，其次為GA3ox1和GA20ox1，表達量分別為3.86和4.58，達到極顯著水平(P<0.01)。葉組織中所有目的基因均表現(xiàn)為上調，最高為GA3ox1的6.40，其次為GA20ox1的5.44，且均達極顯著水平(P<0.01)。葉組織內KS、GA2ox1表達量較小，為1.28和1.34。該生長階段內，植株的營養(yǎng)生長逐漸降低，表現(xiàn)為根莖GA2ox1基因表達量升高；此時棉桃生長發(fā)育至脫水成熟，需要內源GAs的促進與調控，表現(xiàn)為植株葉組織中GA3ox1、GA20ox1基因及GAs受體基因GID1B表達量上調。

2.5 棉花GAs合成相關酶基因在不同生長階段的表達變化

赤霉素合成途徑相關酶基因在根組織內隨生長發(fā)育變化趨勢如圖6所示。以幼苗期根組織為對照，CPS1、KO、GA3ox1、GA20ox1和GID1B基因均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，KS、GA2ox1基因則表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢。CPS1、GA3ox1、GA20ox1、GID1B基因表達量在開花期上調幅度均超過2倍，其中以GID1B上調幅度最大，為4.44，到吐絮期，CPS1、GA3ox1、GA20ox1、GID1B基因表達量逐漸下降，CPS1、GA20ox1、GID1B下降到對照水平以下，GA3ox1基因雖然降低，但仍維持在2.39水平。KO基因幼苗期和開花期表達量變化不大，到吐絮期稍有降低。相比于KS基因，GA2ox1基因表達量上升趨勢更為明顯，其開花期表達量為3.59，后逐漸上升到吐絮期的5.55。

圖5 吐絮期GAs合成途徑各關鍵酶基因在棉花各組織內的表達情況Fig.5 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton tissues in boll opening stage

圖6 Z571根組織GAs合成途徑各關鍵酶基因的表達情況Fig.6 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton root

莖組織內各基因的表達變化趨勢如圖7所示，CPS1基因表達量在3個時期表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，由幼苗期的3.75下降為吐絮期的0.88；GA2ox1基因表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，表達量由幼苗期的0.22逐漸上升為吐絮期的4.51；KS、KO、GA3ox1、GA20ox1、GID1B基因表達量均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，且GA3ox1、GA20ox1、GID1B基因表達量一直維持在對照水平以上，其中GA20ox1在開花期的表達量達到了21.79，表明在開花期階段，莖組織內GA20ox1基因表達活躍，為棉花植株的果枝的伸長、花器官發(fā)育及成鈴提供充足的活性GAs。

葉組織內各目的基因的表達變化趨勢如圖8所示，CPS1、KS、KO、GA20ox1和GID1B基因表達量在3個時期內逐漸升高，GA2ox1和GA3ox1基因表達為先升高后下降。幼苗期內，葉組織中的CPS1、KS和KO基因表達量相對較低，尤其是KS基因，其在幼苗期與開花期內的表達量分別為0.02和0.09。GA2ox1基因在幼苗期低于對照水平，到開花期表達量達到升高，到吐絮期又回歸到正常水平；GA3ox1基因表達量始終處于較高水平，且到開花期達22.44，吐絮期有所降低；GA20ox1和GID1B基因的表達量呈逐漸升高的趨勢，可能與后期棉桃的成熟吐絮有關。

圖7 Z571莖組織GAs合成途徑各關鍵酶基因的表達情況Fig.7 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton stem

圖8 Z571葉組織GAs合成途徑各關鍵酶基因的表達情況Fig.8 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton leaf

3 討論與結論

赤霉素作為一種重要的植物激素，它能控制植物生長發(fā)育的多個方面，包括根系的生長、莖的伸長、葉的展開、種子萌發(fā)和花的發(fā)育等，這必然要求植物對體內的赤霉素水平進行精確的調控，而這種調控主要是通過控制GA合成代謝途徑各種酶基因的表達來實現(xiàn)的。近年來隨著植物功能基因組學和蛋白質組學的發(fā)展，赤霉素研究取得重大進展，特別是赤霉素生物合成途徑，起關鍵作用的酶基因已在許多植物中克隆出來[17-18]。在這些關鍵酶基因中，CPS、KS和KO在赤霉素的合成早期起作用，其只參與一步反應，GA2ox、GA20ox和GA3ox則參與多步反應，發(fā)生在赤霉素合成后期，催化具有生物活性赤霉素的合成[19]。研究表明，CPS作為赤霉素合成途徑的起始關鍵基因，直接影響植物赤霉素的產生，從而嚴重影響植物的發(fā)育，若CPS完全突變，植物將不能產生赤霉素[20]。在赤霉素合成途徑中，CPS和KS的催化作用被認為是在總體水平上調控赤霉素合成的關鍵位點[21]。水稻中阻礙KO的催化步驟則會影響活性赤霉素的合成，最終導致植物矮化[22]。GA2ox是在赤霉素合成途徑中起負調控作用的關鍵酶，起到將有生物活性的GA1和GA4變成無生物活性的GA8和GA34的分解作用，活性GAs的減少必然影響植物的生長發(fā)育[23-24]。水稻和玉米中，由于GA3ox基因的突變，導致了植株矮化的發(fā)生[3,25]。GA20ox是嚴格調控的酶，既受活性GA反饋調節(jié)，又受光周期調控，過量表達GA20ox，植物通常會表現(xiàn)為節(jié)間伸長，葉色變淡等特征[18]。赤霉素受體(GID)是赤霉素信號轉導途徑的重要成員，直接影響著赤霉素對植物體效應的發(fā)揮，研究表明，在外源GA3誘導下，MsGID1B基因的表達量較高，可能參與紫花苜蓿的抗逆調控[26]。近年來，通過轉基因方法，人們對GA生物合成通路中所涉及到的基因進行了一系列的操作，有利于了解它們在植物發(fā)育過程中所起的作用和具體的控制過程，例如談心等[27]利用RNA干擾技術，構建了煙草GA 20-氧化酶基因RNAi植物表達載體，經轉化煙草植株后，有效地干擾了煙草GA 20-氧化酶基因的表達，從而影響煙草植株體內活性GAs的合成，影響植株的生長發(fā)育，導致植株矮化。Yamaguchi等[28]在南瓜中發(fā)現(xiàn)CPS基因表達水平會根據(jù)不同發(fā)育階段變化，在幼嫩的組織中極為豐富，之后隨著衰老程度增加而降低。

本研究結果表明，隨著棉花植株的生長發(fā)育，赤霉素合成途徑相關基因在不同組織及不同時期內的表達量各不相同。幼苗期，棉花植株生長速率較快，需要充足的養(yǎng)分與激素來滿足與調節(jié)植株的生長發(fā)育，該期間主要以根的生長與莖的伸長為主，表現(xiàn)為莖中起正向調控的相關酶基因GA3ox1和GA20ox1表達量較高，以促進活性GAs的合成。開花期，GAs相關基因表達量發(fā)生較大變化，各目的基因在根莖組織內的表達量均有不同程度的上調；莖中GA20ox1基因表達量最大，為21.79，其次為GA3ox1的4.44；葉組織中GA3ox1表達量最大，為22.44。莖中GA20ox1基因的高表達為植株莖的伸長及果枝發(fā)育提供必要的活性赤霉素水平，這與Huang等[29]研究結果相一致，GA-3氧化酶同GA-20氧化酶類似，也是嚴格調控的酶，受反饋調節(jié)和光周期調控，在GAs合成途徑中起正向調控作用[30-32]，莖、葉、花組織中的GA3ox1、GA20ox1基因表達量較高，推測可能與開花成鈴有關。吐絮期，棉花植株以棉桃的脫水成熟吐絮為主，植株的營養(yǎng)生長逐漸降低，表現(xiàn)為根莖GA2ox1基因表達量升高，根莖部位活性赤霉素含量降低，葉組織中GA3ox1、GA20ox1基因及GAs受體基因GID1B的高表達量，可以正向促進葉片中活性赤霉素含量，為棉桃生長發(fā)育與脫水成熟提供必要的激素水平，與前人研究一致[33]。GIDB作為GAs的受體基因，能與赤霉素結合形成二聚體，將赤霉素的信號傳遞給下游元件，在植物體上產生赤霉素效應。

綜上所述，本研究通過對棉花品種“中571”植株體內赤霉素合成相關酶基因的表達量進行檢測，發(fā)現(xiàn)各目的基因在不同組織內的表達量有所差異。且隨著生長發(fā)育的進行，棉花植株根莖葉組織內赤霉素合成相關基因的表達量變化趨勢存在一定差異。幼苗期莖組織內GA3ox1和GA20ox1表達量較高，為植株的生長發(fā)育提供了充足的激素水平；開花期，莖、葉、花組織中的GA3ox1、GA20ox1基因表達可能與開花成鈴有關；吐絮期，根莖組織GA2ox1基因表達量升高，活性GAs合成降低，葉組織中GA3ox1、GA20ox1基因及GAs受體基因GID1B表達量上調，為棉桃生長發(fā)育與脫水成熟提供了必要的激素水平。