不同預(yù)處理方法下玉米芯水解效果的比較研究

李永蓮, 陽元娥, 黎妍文, 劉文鋒

(1.廣東輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 a.生態(tài)環(huán)境技術(shù)學(xué)院; b.食品與生物技術(shù)學(xué)院, 廣東 廣州 510300；2.五邑大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，廣東 江門 529020)

玉米不僅是全世界總產(chǎn)量最高的糧食作物，還是動(dòng)物重要的飼料來源。玉米發(fā)源于墨西哥，在全球范圍內(nèi)廣泛分布，是深受人們喜愛的主要食物之一。玉米芯作為玉米經(jīng)食用后留下的農(nóng)業(yè)廢棄物，長期得不到廣泛利用，既造成環(huán)境污染，又帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。玉米芯主要成分包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等，因此再利用價(jià)值高。目前國內(nèi)外利用玉米芯生產(chǎn)燃料乙醇、生物柴油等生物能源，既可解決玉米芯的處置問題，又符合社會(huì)可持續(xù)發(fā)展要求。 但是纖維素和半纖維素因被木質(zhì)素包裹，且纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)對(duì)生物降解具有一定的抑制作用[1]，從而難以被降解。如果對(duì)纖維素和半纖維素直接進(jìn)行糖化，水解得率相當(dāng)?shù)停y以實(shí)現(xiàn)直接生物轉(zhuǎn)化。因此，在玉米芯發(fā)酵之前需進(jìn)行預(yù)處理，即將固相中微生物可利用的有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)移到液相中，破壞木質(zhì)素的包裹作用，降低玉米芯纖維素的結(jié)晶程度，增加葡萄糖的含量，提高玉米芯的發(fā)酵效率。

為了增強(qiáng)玉米芯后續(xù)發(fā)酵效果，本文以玉米芯為原料，采用蒸餾水、稀酸、堿、酶等10種不同預(yù)處理方法分別對(duì)玉米芯進(jìn)行預(yù)處理，測(cè)定預(yù)處理后水解液中葡萄糖的含量，采用傅立葉變換紅外光譜(FTIR)觀察預(yù)處理后玉米芯的纖維結(jié)晶結(jié)構(gòu)變化，采用掃描電鏡(SEM)觀察預(yù)處理后玉米芯的纖維表面形態(tài)變化，以期找到一種經(jīng)濟(jì)且適于工業(yè)化生產(chǎn)的玉米芯的預(yù)處理方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米芯，購自廣西桂林，粉碎后過60目篩，置于75 ℃烘箱烘至恒重，然而置于樣品袋干燥保存；纖維素酶和半纖維素酶，購自諾維信(中國)投資有限公司；微生物菌，由廣東工業(yè)大學(xué)天然藥物與綠色化學(xué)研究所篩選培養(yǎng)所得；菌種液體培養(yǎng)基(PDA 培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂16 g、水1 000 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

所選實(shí)驗(yàn)儀器為電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司生產(chǎn))、KDC-16H 高速離心機(jī)(中佳公司生產(chǎn))、立式壓力蒸汽滅菌器(江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn))、微量移液器(上海聯(lián)圣實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn))、T-6 紫外-可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司生產(chǎn))、Quanta 400F 熱場(chǎng)發(fā)射環(huán)境掃描電鏡(荷蘭飛利浦 FEI公司生產(chǎn))、TENSOR 37型傅立葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司生產(chǎn))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

(1) 玉米芯的蒸餾水預(yù)處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL蒸餾水，設(shè)計(jì) 2 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在濕熱高壓滅菌鍋中于 120 ℃預(yù)處理1 h。

(2) 玉米芯的1.0%H2SO4預(yù)處理，稱取玉米芯 10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL 1.0%稀H2SO4，設(shè)計(jì)2 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在濕熱高壓滅菌鍋中于120 ℃預(yù)處理1 h。

(3) 玉米芯的1.0%NaOH預(yù)處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL 1.0%NaOH，設(shè)計(jì)2個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在濕熱高壓滅菌鍋中于25 ℃預(yù)處理0.5 h。

(4) 玉米芯的微生物預(yù)處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入30 mL微生物，設(shè)計(jì)2個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，置于35 ℃、100 rad/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h。

(5) 玉米芯的纖維素酶預(yù)處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL蒸餾水，利用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)液體pH值至5.5，加入纖維素酶1 mL，設(shè)計(jì)2個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，置于恒溫?fù)u床，在40 ℃、100 rad/min條件下培養(yǎng) 48 h[2]。

(6) 玉米芯的半纖維素酶預(yù)處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL蒸餾水，利用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)液體pH值至4.8，加入半纖維素酶0.1 mL，設(shè)計(jì)2個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，置于恒溫?fù)u床，在40 ℃、100 rad/min條件下培養(yǎng)48 h[2]。

(7) 玉米芯的半纖維素酶協(xié)同纖維素酶預(yù)處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入120 mL蒸餾水，利用NaOH稀溶液調(diào)節(jié)液體pH值至5.0，加入纖維素酶1 mL、半纖維素酶0.1 mL，設(shè)計(jì)2個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，置于恒溫?fù)u床，在40℃、100 rad/min條件下培養(yǎng)48 h[2]。

(8) 玉米芯的1.0%H2SO4強(qiáng)化纖維素酶預(yù)處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入1.0%稀H2SO4120 mL，設(shè)計(jì)2個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在濕熱高壓滅菌鍋中于120 ℃預(yù)處理1 h，冷卻后用NaOH溶液調(diào)節(jié)液體pH至5.5，然后加入纖維素酶1 mL，置于40 ℃、100 rad/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h。

(9) 玉米芯的1.0%H2SO4強(qiáng)化半纖維素酶預(yù)處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入1.0%稀H2SO4120 mL，設(shè)計(jì)2個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在濕熱高壓滅菌鍋中于120 ℃預(yù)處理1 h，冷卻后用NaOH溶液調(diào)節(jié)液體pH至4.8，然后加入半纖維素酶0.1 mL，置于40 ℃、100 rad/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h。

(10) 玉米芯的1.0%H2SO4強(qiáng)化半纖維素酶協(xié)同纖維素酶預(yù)處理，稱取玉米芯10.0 g，置于錐形瓶中，加入1.0%稀H2SO4120 mL，設(shè)計(jì)2個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在濕熱高壓滅菌鍋中于120 ℃預(yù)處理1 h，冷卻后用NaOH溶液調(diào)節(jié)液體pH至5.0，然后加入纖維素酶1 mL、半纖維素酶0.5 mL，置于40 ℃、100 rad/min 恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h。

1.4 分析方法

采用 DNS 法(3，5-二硝基水楊酸法)[3]進(jìn)行葡萄糖含量的測(cè)定，采用環(huán)境掃描電鏡觀察玉米芯試樣噴金后的纖維表面形態(tài)變化[4]，采用傅立葉變換紅外光譜儀掃描預(yù)處理后的玉米芯樣品，觀察纖維素結(jié)晶結(jié)構(gòu)變化情況[5]。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖含量的測(cè)定

用蒸餾水按適當(dāng)倍數(shù)稀釋離心后的玉米芯水解液，取適量溶液，按 DNS 法(3，5-二硝 基水楊酸法)測(cè)定葡萄糖含量，計(jì)算葡萄糖轉(zhuǎn)化率，結(jié)果見表1。

表1 不同預(yù)處理方法下玉米芯水解液的葡萄糖轉(zhuǎn)化率 %

由表1數(shù)據(jù)可以看出：

(1) 在蒸餾水加壓處理下，玉米芯水解液中雖有葡萄糖檢出，但是含量不高。

(2) 1.0%H2SO4處理，由于纖維素和半纖維素在酸性條件下穩(wěn)定性較低，在一定的溫度和壓強(qiáng)下對(duì)其降解產(chǎn)生的葡萄糖較多，所以此種情況的玉米芯水解液中葡萄糖含量較高。

(3) 1.0%NaOH 處理，因?yàn)閴A主要對(duì)木質(zhì)素起作用，對(duì)纖維素和半纖維素的影響不大，所以經(jīng)堿預(yù)處理后的玉米芯水解液中葡萄糖含量較低。

(4) 微生物處理，因?yàn)槲⑸锛饶芊置诔隼w維素酶，又能分泌出半纖維素酶，所以玉米芯水解液中葡萄糖含量較高。

(5) 直接酶法處理，半纖維素酶法處理效果不太好，較纖維素酶法處理效果差，而半纖維素酶協(xié)同纖維素酶法處理效果較好，水解效率較高，水解后溶液中的葡萄糖含量比單一的半纖維素酶法和纖維素酶法處理后高。

(6) 1.0% H2SO4強(qiáng)化酶法處理，經(jīng)稀酸預(yù)處理后，纖維素和半纖維素部分被水解到溶液中，酶與纖維素和半纖維素接觸更有效，酶解效率明顯提高，可見稀酸強(qiáng)化酶法預(yù)處理效果較好。

綜上所述，與堿法及直接酶法相比較，稀酸法預(yù)處理效果更好；直接酶法與稀硫酸強(qiáng)化酶法相比較，稀硫酸強(qiáng)化酶預(yù)處理效果更佳。另外，在半纖維素酶的協(xié)同作用下，纖維素酶的水解作用進(jìn)一步提升。在10種預(yù)處理方法中，1.0% H2SO4強(qiáng)化半纖維素酶協(xié)同纖維素酶法預(yù)處理效果最佳，其次是1.0%H2SO4強(qiáng)化纖維素酶法，最后是1.0%H2SO4法。綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本，最優(yōu)方法是1.0%H2SO4預(yù)處理法。

2.2 玉米芯的紅外吸收光譜分析

圖1為玉米芯的紅外吸收光譜圖。由圖1可見，經(jīng)1.0% H2SO4、1.0% NaOH、半纖維素酶預(yù)處理后玉米芯的紅外吸收光譜圖與經(jīng)原料玉米芯、蒸餾水預(yù)處理玉米芯的紅外吸收光譜圖相比，其中相同點(diǎn)為：3 350 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是形成氫鍵的羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰，這是纖維素中纖維的特征譜帶；2 900 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰屬于纖維素中亞甲基基團(tuán)的伸縮振動(dòng)吸收峰。在3 350 cm-1和2 900 cm-1處的吸收峰強(qiáng)度變?nèi)?，表明碳水化合物部分分解，致使羥基和亞甲基基團(tuán)減少。不同點(diǎn)主要有：① 1 700 cm-1處為羰基伸縮振動(dòng)吸收峰，對(duì)比預(yù)處理前后該吸收峰發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1.0% H2SO4和1.0%NaOH預(yù)處理后，該峰強(qiáng)度有所降低，但用酶處理后此處吸收峰基本消失，說明玉米芯的羧酸酯類化合物和酮類化合物在預(yù)處理時(shí)較大部分被水解。② 1 500 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰為苯環(huán)芳香核振動(dòng)吸收峰，經(jīng)1.0% H2SO4和酶預(yù)處理后，該峰強(qiáng)度有所下降，而用1.0%NaOH預(yù)處理后這個(gè)峰基本消失，說明預(yù)處理對(duì)木質(zhì)素有一定的破壞，而1.0%NaOH對(duì)木質(zhì)素的破壞最大。③ 纖維素組分最重要的兩個(gè)特征峰為1 420 cm-1處吸收峰(纖維素中無定形區(qū)結(jié)構(gòu)及纖維素Ⅱ構(gòu)型)和1 430 cm-1處吸收峰(纖維素Ⅰ結(jié)晶區(qū)構(gòu)型)。其中，經(jīng)1.0%NaOH預(yù)處理后，1 430 cm-1處吸收峰強(qiáng)度有所增強(qiáng)，這說明經(jīng)堿處理后樣品結(jié)晶結(jié)構(gòu)比例有所增長。而經(jīng)1.0% H2SO4預(yù)處理后，1 430 cm-1處吸收峰強(qiáng)度有所下降，這說明經(jīng)酸處理后樣品結(jié)晶結(jié)構(gòu)部分被破壞。④ 經(jīng)1.0% H2SO4預(yù)處理后，1 255 cm-1、1 100 cm-1和898 cm-1處的吸收峰都下降為肩狀，表明此種情況下玉米芯中的纖維素、半纖維素、糖類及其他碳水化合物部分被分解。這些結(jié)論與文獻(xiàn)[5-6]中所報(bào)道的結(jié)果較一致。

綜上所述，經(jīng)不同方法預(yù)處理后玉米芯的結(jié)構(gòu)均有變化，其中經(jīng)1.0% H2SO4預(yù)處理后的變化較大，如碳水化合物分解，羧酸酯類化合物和酮類化合物水解，對(duì)木質(zhì)素有一定的破壞，結(jié)晶結(jié)構(gòu)破壞、纖維素、半纖維素、糖類及其他碳水化合物部分被分解等等。這些變化說明，用1% H2SO4預(yù)處理玉米芯有利于其后續(xù)發(fā)酵。

a.原料玉米芯；b.蒸餾水預(yù)處理玉米芯；c.1.0% H2SO4預(yù)處理玉米芯；d.1.0% NaOH預(yù)處理玉米芯；e. 半纖維素酶協(xié)同纖維素酶預(yù)處理玉米芯圖1 玉米芯紅外吸收光譜譜圖

2.3 玉米芯纖維表面形態(tài)的掃描電鏡分析

通過比較同一放大倍數(shù)(1 000×)不同預(yù)處理方法下的玉米芯纖維表面形態(tài)的掃描電鏡譜圖(圖2)發(fā)現(xiàn)：原料玉米芯纖維的原始形貌清晰可見，纖維沒有斷裂，也未發(fā)現(xiàn)微孔(圖2(a))；經(jīng)蒸餾水預(yù)處理后玉米芯的表面形貌明顯較原料玉米芯粗糙，出現(xiàn)極少部分微孔，未觀察到纖維斷裂(圖2(b))；經(jīng)1.0%H2SO4預(yù)處理后玉米芯纖維的結(jié)晶結(jié)構(gòu)明顯被破壞，纖維表面出現(xiàn)分絲甚至斷裂現(xiàn)象，且出現(xiàn)了許多孔洞(圖 2(c)和圖3)。這個(gè)結(jié)果與文獻(xiàn)[7]中所報(bào)道的現(xiàn)象較為一致。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是H2SO4脫除了大部分半纖維素，破壞了纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，說明1.0%H2SO4預(yù)處理法對(duì)玉米芯的后續(xù)發(fā)酵起到積極作用，是玉米芯水解的好方法。

(a) 原料玉米芯 (b) 蒸餾水預(yù)處理玉米芯 (c)1% H2SO4預(yù)處理玉米芯圖2 玉米芯纖維表面形態(tài)的掃描電鏡譜圖

(a) 200× (b)500×

(c) 1000× (d) 3000×圖3 不同放大倍數(shù)下1.0%H2SO4預(yù)處理玉米芯的掃描電鏡譜圖

3 結(jié) 論

(1) 在10 種預(yù)處理方法中，1.0% H2SO4強(qiáng)化半纖維素酶協(xié)同纖維素酶預(yù)處理效果最佳，其次是1.0% H2SO4強(qiáng)化纖維素酶法，最后是1.0% H2SO4法。綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本，最優(yōu)方法為1.0% H2SO4預(yù)處理法。

(2) 通過紅外吸收光譜分析經(jīng)1.0% H2SO4預(yù)處理后玉米芯的變化可知：碳水化合物分解，羧酸酯類化合物和酮類化合物水解，對(duì)木質(zhì)素有一定的破壞，結(jié)晶結(jié)構(gòu)破壞，纖維素、半纖維素、糖類及其他碳水化合物部分被分解，這些變化說明用1.0% H2SO4預(yù)處理玉米芯非常有利于其后續(xù)發(fā)酵。

(3) 通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)1.0% H2SO4預(yù)處理后玉米芯的形貌發(fā)生了明顯形態(tài)學(xué)上的變化：大部分半纖維素被脫除，纖維素的結(jié)晶結(jié)構(gòu)明顯被破壞。