大蒜素對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響

郭燕軍 ，劉洪利 ，陳 勇，閆 威 ，溫 凱

（1.滄州市中心醫(yī)院口腔頜面外科，滄州 061001；2.滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，滄州 061000）

大蒜素是一種天然存在的二烯丙基三硫化物，近代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大蒜素能夠通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、影響細(xì)胞周期等不同作用機(jī)制對(duì)卵巢癌、宮頸癌、胃癌等起到一定的抑制作用[1-3]，而大蒜素是否能夠促進(jìn)舌鱗狀癌細(xì)胞凋亡并影響其細(xì)胞周期尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，本研究將通過體外培養(yǎng)人舌鱗狀癌Tca8113細(xì)胞并給予不同劑量大蒜素進(jìn)行干預(yù)，探討大蒜素對(duì)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，并初步探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、藥物與試劑 人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞株由河北醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室惠贈(zèng)。大蒜素注射液購自黑龍江迪龍制藥有限公司[規(guī)格：2 mL（30 mg）]；注射用順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司[規(guī)格：6 mL（30 mg）]；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自德國Bendermed公司；B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān) X 蛋白（Bax）引物購自上海博亞生物公司；cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2多克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株經(jīng)解凍復(fù)蘇后體外培養(yǎng)，取處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，設(shè)空白對(duì)照組、大蒜素（50、25、12.5μg/mL）組和順鉑（40μg/mL）組，每組設(shè)12個(gè)復(fù)孔，給藥干預(yù)48 h后行各指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)：各組細(xì)胞經(jīng)1 000 r/min離心5 min后棄上清液，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次后，加5 mL濃度為70%乙醇混勻，4℃環(huán)境放置48 h后，離心去除乙醇，PBS洗滌3次，加5μL濃度為10 mg/mL水解酶Rnase，1 h后加入濃度為100μg/mL的碘化丙啶染液，室溫避光孵育30 min后通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析檢測(cè)，采用CELLQuest軟件分析細(xì)胞周期時(shí)相及凋亡狀況。

1.2.3 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法：查閱大鼠Bcl-2、Bax、內(nèi)參β-actin基因cDNA序列并設(shè)計(jì)上、下游引物，常規(guī)消化并收集各組細(xì)胞，加入適量TRIzol試劑提取總RNA，測(cè)定總RNA濃度，取1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增完畢后，取PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像儀觀察并照相。根據(jù)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參半定量分析Bcl-2 mRNA、Bax mRNA表達(dá)并計(jì)算Bax/Bcl-2值。

1.2.4 Cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表達(dá)的檢測(cè) 采用蛋白免疫印跡法：超聲碎裂細(xì)胞，經(jīng)12 000 r/min低溫（4℃）離心20 min處理后取沉淀，BCA法行蛋白定量后實(shí)施高溫蛋白變性，電泳：待溴酚藍(lán)接近膠底部時(shí)停止、轉(zhuǎn)膜、麗春紅溶液染色，室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2、β-actin（1∶500）4 ℃過夜；洗膜，二抗（1∶100）室溫?fù)u床上孵育1 h后經(jīng)ECL顯色。根據(jù)條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參半定量分析cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞凋亡狀況Fig.1 Apoptosis of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cellsin each group

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果 大蒜素（50、25μg/mL）組和順鉑組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞處于DNA合成前期（G0/G1）期比例較空白對(duì)照組顯著降低而DNA合成后期（G2/M）期比例顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），提示大蒜素能夠阻滯Tca8113細(xì)胞有絲分裂；與順鉑組比較，大蒜素50μg/mL組Tca8113細(xì)胞G2/M期比例顯著升高（P＜0.05），兩組間G0/G1期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞細(xì)胞周期（Tab.1 Cell cycle of human tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group（%

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，#P＜0.05。

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2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 大蒜素（50、25、12.5μg/mL）組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞凋亡率為（73.1±8.6）%、（45.8±6.7）%、（21.3±5.9）%，順鉑組為（28.8±4.5）%，與空白對(duì)照組（2.4±1.5）%比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與順鉑組比較，大蒜素（50、25μg/mL）組Tca8113細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01）。結(jié)果見圖 1。

2.3 Bcl-2 mRNA、Bax mRNA檢測(cè)結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，大蒜素（50、25、12.5 μg/mL）組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.05 或 P＜0.01），大蒜素（50、25 μg/mL）組 Bax mRNA表達(dá)顯著上調(diào)、Bax/Bcl-2比值顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與順鉑組比較，大蒜素50μg/mL組Bcl-2 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)、Bax/bcl-2比值顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表 2。

表2 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 表達(dá)和 Bax/Bcl-2比值Tab.2 The expressions of Bcl-2 mRNA,Bax mRNA and theratio of Bax/Bcl-2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

表2 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞Bcl-2 mRNA、Bax mRNA 表達(dá)和 Bax/Bcl-2比值Tab.2 The expressions of Bcl-2 mRNA,Bax mRNA and theratio of Bax/Bcl-2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，#P＜0.05。

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表3 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2表達(dá)Tab.3 The expression of cyclin B1,cyclin D1,CDK1,CDK2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

表3 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2表達(dá)Tab.3 The expression of cyclin B1,cyclin D1,CDK1,CDK2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cells in each group

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，#P＜0.05。

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2.4 Cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果 大蒜素（50、25μg/mL）組和順鉑干預(yù)組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞cyclin B1蛋白、CDK1蛋白較空白對(duì)照組顯著上調(diào)，cyclin D1蛋白、CDK2蛋白顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與順鉑組比較，大蒜素50μg/mL組cyclin B1表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05），CDK2表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01），兩組間 cyclin D1、CDK1 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖2和表3。

3 討論

口腔頜面部腫瘤占全身惡性腫瘤10%左右，其中口腔鱗癌最為多見。舌鱗狀細(xì)胞癌占口腔癌40%左右[4]，具有生長快、浸潤性強(qiáng)、轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后差的特點(diǎn)[5]，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。目前，臨床上采用常規(guī)手術(shù)切除結(jié)合術(shù)前術(shù)后化療的治療方案，但治愈率僅30%左右，化療耐藥性的產(chǎn)生是療效降低并最終導(dǎo)致舌鱗狀細(xì)胞癌復(fù)發(fā)的主要原因。因此，迫切需要研究高效、低毒、敏感性高的新型抗腫瘤藥物。

圖2 各組人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2 蛋白表達(dá)Fig.2 The expression of cyclin B1,cyclin D1,CDK1,CDK2 of tongue squamous cell carcinoma Tca8113 cellsin each group

大蒜素是一種天然存在的二烯丙基三硫化物，既往張飛鳳等[1]、劉玲等[2]、佘玉清等[3]研究發(fā)現(xiàn)大蒜素具有抑制卵巢癌SKOV-3細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞、胃癌MKN-45細(xì)胞生長，且具有時(shí)間和劑量依賴性，其作用機(jī)制可能與大蒜素能夠通過破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、阻滯細(xì)胞有絲分裂、抑制細(xì)胞增殖等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)大蒜素干預(yù)能夠阻滯細(xì)胞周期于G2/M期而抑制細(xì)胞有絲分裂，提高細(xì)胞凋亡率；并且與順鉑組比較，大蒜素50μg/mL組Tca8113細(xì)胞G2/M期比例顯著升高。

Bcl-2基因家族Bcl-2、Bax是細(xì)胞凋亡過程中重要的調(diào)控基因，其中Bcl-2能夠抑制細(xì)胞色素C釋放、抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）激活、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，從而表現(xiàn)出抑制細(xì)胞凋亡的作用[6]；Bax具有破壞線粒體滲透性、激活Caspase-3而表現(xiàn)出促細(xì)胞凋亡作用[7]；Saeedi Borujeni MJ等[8]研究發(fā)現(xiàn)Bax與Bcl-2能夠聚合成二聚體，從而相互抑制活性，所以Bax/Bcl-2比值更加能夠體現(xiàn)兩者對(duì)細(xì)胞凋亡的實(shí)際調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)大蒜素干預(yù)能夠顯著下調(diào)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞Bcl-2mRNA表達(dá)、上調(diào)BaxmRNA表達(dá)而顯著提高Bax/Bcl-2比值，這可能是大蒜素誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡的重要分子機(jī)制之一。

細(xì)胞周期過程有多種基因蛋白參與調(diào)控，其中周期蛋白依賴性激酶CDK2是細(xì)胞周期G2期運(yùn)行的必要因子，而CDK1則調(diào)控腫瘤細(xì)胞從G2期過渡到M期，從而使細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂周期[9]。周期相關(guān)調(diào)控蛋白周期蛋白Cyclin B1是G2/M期的重要調(diào)控蛋白，Cyclin B1能夠與CDK1組成促有絲分裂因子（MPF），MPF能夠促使細(xì)胞G2期過渡到M期。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)大蒜素干預(yù)能夠顯著上調(diào)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞cyclin B1蛋白和CDK1蛋白表達(dá)，顯著下調(diào)cyclin D1蛋白和CDK2蛋白表達(dá)，這可能是大蒜素通過阻滯細(xì)胞有絲分裂而抑制Tca8113細(xì)胞增殖的重要分子機(jī)制。

綜上所述，大蒜素可能通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞有絲分裂而對(duì)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞生長起到一定的抑制作用，其分子機(jī)制可能與大蒜素影響凋亡相關(guān)調(diào)控基因（Bcl-2、Bax）及細(xì)胞周期相關(guān)調(diào)控蛋白（cyclin B1、cyclin D1、CDK1、CDK2）表達(dá)有關(guān)。