基于HS-SPME-GC-MS法優(yōu)化醬牛肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取條件

李 娟,韓 東,米 思,李 俠,張春暉

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點實驗室,北京 100193)

醬牛肉是我國傳統(tǒng)醬鹵肉制品中的特色產(chǎn)品,其香味濃郁,口感豐厚,受到廣大消費者的喜愛和推崇[1]。醬牛肉是將牛肉預(yù)煮后,用肉桂、丁香、黃醬、料酒等香辛料和調(diào)味料煮制的肉制品,因其配料和加工方式不同,使醬牛肉具有不同的風(fēng)味。風(fēng)味是評價醬牛肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一,同時也是消費者購買產(chǎn)品的重要依據(jù)。風(fēng)味的形成是由于加工過程中美拉德反應(yīng)、脂肪氧化降解、硫胺素?zé)峤到獾裙餐饔玫慕Y(jié)果[2]。近年來,對醬牛肉中風(fēng)味物質(zhì)的相關(guān)研究有大量文獻(xiàn)報道,主要集中在醬牛肉風(fēng)味物質(zhì)不同分析方法的對比[3-4]、醬牛肉加工過程中風(fēng)味物質(zhì)含量變化[4-5]、醬牛肉風(fēng)味物質(zhì)形成等方面[6-7]。對于醬牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取條件優(yōu)化方面研究較少。

目前,風(fēng)味物質(zhì)提取方法多采用同時蒸餾萃取法、微波輔助萃取法[8]、溶劑輔助蒸發(fā)法[9]、熱脫附法[10]、固相微萃取法等。固相微萃取(solid phase micro-extraction,SPME)作為一種集吸附、濃縮、進(jìn)樣為一體的無溶劑樣品前處理方法,被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥及環(huán)境等領(lǐng)域,具有操作方便,樣品用量少,靈敏度高等特點[11]。對于肉制品的風(fēng)味物質(zhì)前處理,Ma等人[12]運用SPME-GC-MS進(jìn)行了煮制牛肉中風(fēng)味物質(zhì)的提取和鑒定,得到24種風(fēng)味成分;郭青雅等人[13]對羊肉臊子的風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究,用SPME法提取后,確定了35種氣味化合物;Corral等人[14]采用SPME-GC-MS技術(shù)研究了發(fā)酵香腸中的風(fēng)味物質(zhì),共檢出95種化合物;Iglesias等人[15]用SPME-GC-MS技術(shù)對氧化魚肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究,共鑒定出79種化合物。故本文運用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(Headspace solid phase micro-extraction and gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)聯(lián)用技術(shù)研究醬牛肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),對固相微萃取法進(jìn)行條件優(yōu)化,建立醬牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定的最佳分析方法,初步確定醬牛肉中重要的風(fēng)味物質(zhì),以期為今后醬牛肉風(fēng)味品質(zhì)調(diào)控提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

稻香村醬牛肉(真空包裝,300 g) 北京稻香村專賣店,保質(zhì)期為90 d,主要配料有牛肉、黃醬、香辛料、醬油、白酒、大豆分離蛋白等。

QP 2010 Plus型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司;100 μm 聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)、65 μm聚二甲基硅氧烷/二乙基苯(polydimethylsiloxane/divinylbenzene,PDMS/DVB)、50/30 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)、自動SPME進(jìn)樣器 美國Supelco公司;Waring SS110實驗室組織搗碎機(jī) 上海默西科學(xué)儀器有限公司;20 mL頂空進(jìn)樣瓶 寧波哈邁儀器科技有限公司;賽多利斯BSA423S電子天平 賽多利斯(中國)有限公司;YC-300L低溫冷藏柜 中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 剔除醬牛肉表面凍鹵、可見筋腱,將剩余醬牛肉用組織搗碎機(jī)搗碎至顆粒狀。之后稱取一定量樣品置于20 mL頂空進(jìn)樣瓶,旋緊瓶蓋。在分析測定前,放于4 ℃低溫冷藏柜中備用。

1.2.2 氣相色譜質(zhì)譜條件 SPME條件:萃取頭在使用前,應(yīng)在GC進(jìn)樣口老化相應(yīng)時間(100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB萃取頭分別在250 ℃老化0.5 h,50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭在270 ℃老化0.5 h)。取出裝醬牛肉的20 mL頂空進(jìn)樣瓶,將老化完成的萃取頭插入進(jìn)樣瓶,預(yù)熱20 min后在一定溫度條件下吸附一定時間,解析2 min后,進(jìn)行GC-MS分析。

GC條件:DB-WAX型毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);載氣為He,流速1.6 mL/min;分流進(jìn)樣,分流比為2∶1;采用程序升溫,具體為:初始溫度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min上升到120 ℃,再以10 ℃/min升溫至200 ℃,保持33 min。

MS條件:電離方式:EI,電離電壓70 eV,離子源溫度200 ℃,掃描方式為全掃描,掃描范圍m/z 35～500。

1.2.3 萃取頭篩選實驗 稱取3.0 g樣品,預(yù)熱20 min,在60 ℃條件下吸附40 min,后在230 ℃解析2 min,考察 100 μm PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭對醬牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響。

1.2.4 單因素實驗 依據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)的報道[16-21],單因素實驗中選取萃取溫度、萃取時間、解析溫度、樣品質(zhì)量為實驗因素,進(jìn)行相應(yīng)條件優(yōu)化,以研究其對總峰面積、風(fēng)味物質(zhì)種類的影響。

在保持萃取時間為40 min,解析溫度為230 ℃,樣品質(zhì)量3.0 g,及其他條件不變的情況下,分別選取萃取溫度為50、60、70、80、90 ℃進(jìn)行優(yōu)化,以選取合適萃取溫度。

在保持萃取溫度為60 ℃,解析溫度為230 ℃,樣品質(zhì)量3.0 g時,及其他條件不變的情況下,分別進(jìn)行萃取時間30、35、40、45、50 min的頂空固相微萃取實驗,以選取合適萃取時間。

在保持萃取溫度為60 ℃,萃取時間為40 min,樣品質(zhì)量3.0 g,及其他條件不變的情況下,分別進(jìn)行解析溫度200、210、220、230、240 ℃的頂空固相微萃取實驗,以選取合適解析溫度。

在保持萃取溫度為60 ℃,萃取時間為40 min,解析溫度為230 ℃,及其他條件不變的情況下,分別選取樣品質(zhì)量為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 g進(jìn)行優(yōu)化,以選取合適樣品質(zhì)量。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化實驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上,應(yīng)用Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理,以總峰面積作為響應(yīng)值,進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面實驗,確定HS-SPME-GC-MS分析醬牛肉風(fēng)味物質(zhì)的最佳條件。實驗因素及水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表

1.3 定性定量方法

醬牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)通過氣相色譜分離,后經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定,得到總離子色譜圖。利用計算機(jī)檢索并與NIST11質(zhì)譜庫進(jìn)行匹配作初步分析,再結(jié)合人工譜圖解析,確定化合物,完成定性分析;按峰面積歸一法對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0軟件對單因素實驗進(jìn)行分析;利用Design-Expert 8. 0. 5b軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 萃取頭的確定

由表2可知,在相同條件下,65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭分別鑒定出33、32種化合物,而100 μm PDMS萃取頭僅分離得到13種化合物;與其他兩種萃取頭相比,65 μm PDMS/DVB萃取頭有較大總峰面積,故萃取頭選取65 μm PDMS/DVB。

表2 不同萃取頭對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響

2.2 單因素實驗

2.2.1 萃取溫度對萃取效果的影響 萃取溫度對風(fēng)味物質(zhì)的萃取效果有很大影響。其影響通過樣品在三相間的擴(kuò)散系數(shù)和分配系數(shù)來實現(xiàn)。升高萃取溫度時,樣品中分子運動加快,隨之?dāng)U散速率會加快,即擴(kuò)散系數(shù)增大;萃取溫度過高時,使萃取頭固定相發(fā)生解析,從而降低樣品中分子吸附,使分配系數(shù)減小[22]。由圖1可知,隨著萃取溫度的升高,總峰面積先增大后減小,70 ℃時總峰面積達(dá)到最大,而風(fēng)味物質(zhì)種類隨著萃取溫度的升高略有減少?？偡迕娣e、風(fēng)味物質(zhì)種類在70 ℃后下降,可能是不易揮發(fā)的大分子物質(zhì)吸附在萃取頭上,使揮發(fā)性小分子物質(zhì)很難吸附上去,從而使總峰面積、風(fēng)味物質(zhì)種類下降[23]。綜上,選取70 ℃作為萃取溫度進(jìn)行下一步實驗。

圖1 萃取溫度對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響

2.2.2 萃取時間對萃取效果的影響 萃取時間對萃取頭的吸附量和萃取效果有較為重要的影響。SPME是一種基于樣品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在頂空與萃取頭薄膜上的動態(tài)分配平衡過程,而萃取時間即為萃取達(dá)到平衡時所需要的時間,一般萃取過程均在剛開始時吸附量迅速增加,到一定的點位后上升就很緩慢[24-25]。由圖2可知,萃取時間為30～50 min時,風(fēng)味物質(zhì)種類和總峰面積呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,其中,45 min時,風(fēng)味物質(zhì)種類最多。但在40～45 min時,總峰面積變化不顯著(p>0.05),基本趨于平穩(wěn),說明萃取頭在45 min便能達(dá)到飽和。通過分析色譜圖發(fā)現(xiàn),保留時間在40 min后,仍有一些主要風(fēng)味物質(zhì)出現(xiàn),如果縮短萃取時間,將不利于這些物質(zhì)的揮發(fā)和吸附,減少風(fēng)味物質(zhì)析出。因此,選取45 min作為萃取時間。

圖2 萃取時間對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響

2.2.3 解析溫度對萃取效果的影響 解析溫度對固相微萃取時的解析時間和萃取效果有較大的影響,結(jié)果如圖3所示。若解析溫度過低,則有可能因解析不完全,導(dǎo)致下一次的吸附誤差;若解析溫度過高,會使萃取頭涂層脫落,增加含硅物質(zhì)的大量析出,并有可能使一些吸附的風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生氧化等[26-27]。由圖3可知,解析溫度為200～210 ℃時,隨著解析溫度的增大,總峰面積和風(fēng)味物質(zhì)種類減少,可能是210 ℃時萃取頭涂層中含硅物質(zhì)析出,主要風(fēng)味物質(zhì)減少,總峰面積變小。解析溫度為210～230 ℃時,總峰面積、風(fēng)味物質(zhì)種類呈現(xiàn)不斷增加的趨勢,230 ℃達(dá)到最大值,之后隨著解析溫度增大,總峰面積和風(fēng)味物質(zhì)種類開始減小。故選取230 ℃為后續(xù)實驗的解析溫度。

圖3 解析溫度對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響

2.2.4 樣品質(zhì)量對萃取效果的影響 樣品質(zhì)量對萃取時間、萃取效果有較大影響,當(dāng)樣品質(zhì)量越大,萃取頭吸附物質(zhì)越多,總峰面積越大;當(dāng)樣品質(zhì)量過多,會導(dǎo)致預(yù)熱時受熱不均勻,使物質(zhì)不能很好地?fù)]發(fā),相應(yīng)地會降低萃取效果[28]。由圖4可知,樣品質(zhì)量為2.0 g時,總峰面積達(dá)到最大,風(fēng)味物質(zhì)種類也較多,隨后兩者均在減小,可能是萃取頭吸附出現(xiàn)飽和,不能萃取更多的風(fēng)味物質(zhì)[29]。故選取的樣品質(zhì)量為2.0 g。

圖4 樣品質(zhì)量對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)萃取效果的影響

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以萃取溫度(A)、萃取時間(B)、解析溫度(C)、樣品質(zhì)量(D)為影響因素,總峰面積作為響應(yīng)變量,利用Design-Expert 8. 0. 5b軟件設(shè)計響應(yīng)面實驗,結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面設(shè)計方案和結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.5b軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析,得到回歸方程:Y=3.98+4.32A+0.53B+0.85C+0.10D-0.33AB-0.19AD+0.21BC-0.08BD-0.12CD+2.53A2+0.90B2+0.27C2+0.84D2,其中各項系數(shù)的絕對值大小表示各因素對響應(yīng)變量的影響程度。根據(jù)實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面方差分析,結(jié)果見表4。

該擬合模型p值<0.0001,說明模型極顯著(p<0.01),表明實驗方法可行;失擬項不顯著(p=0.2472>0.05),說明回歸方程擬合度較好,實驗誤差比較小;其中決定系數(shù)R2=0.9590,表明回歸方程效果好,預(yù)測具有可靠性。由表4可知,回歸模型中一次項A、C和二次項A2對總峰面積的影響極顯著(p<0.01),說明二次項B2、D2對總峰面積的影響顯著(p<0.05)。從表4所列的F值大小可知,4個因素對總峰面積影響程度大小依次為:萃取溫度>解析溫度>萃取時間>樣品質(zhì)量。

表4 方差分析結(jié)果

用Design-Expert 8.0.5b軟件繪制響應(yīng)面圖,萃取溫度、萃取時間、解析溫度、樣品質(zhì)量兩兩交互作用對響應(yīng)值總峰面積的影響如圖5所示。從5圖中可知,其兩兩交互作用均不顯著。通過對回歸模型進(jìn)行分析,得到固相微萃取的最適條件為:萃取溫度68.95 ℃,萃取時間46.51 min,解析溫度239.89 ℃,樣品質(zhì)量1.68 g,在此條件下,預(yù)測總峰面積為1.44×108?？紤]到實驗可行性和局限性,上述條件修改為:萃取溫度70 ℃,萃取時間45 min,解析溫度240 ℃,樣品質(zhì)量2.0 g,得到總峰面積1.46×108,風(fēng)味物質(zhì)種類為44種,實際總峰面積與理論預(yù)測總峰面積相比,其相對誤差為1.37%,說明響應(yīng)面法對萃取條件的優(yōu)化具有可行性。

圖5 萃取溫度、萃取時間、解析溫度、樣品質(zhì)量兩兩交互作用對萃取效果的影響

2.4 醬牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)檢測

根據(jù)上述最佳萃取條件,對醬牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行萃取,其HS-SPME-GC-MS色譜圖如圖6所示。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類及相對含量結(jié)果見表5。

圖6 醬牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總離子流圖

HS-SPME-GC-MS法檢測到的醬牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)結(jié)果見表5,共檢測出44種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),其中醛類9種(51.29%)、醇類8種(8.61%)、酮類4種(6.49%)、醚類2種(6.75%)、酯類6種(4.76%)、酸類4種(2.43%)、烴類2種(0.58%)、含氮含硫及雜環(huán)化合物9種(16.78%)。

表5 醬牛肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和相對含量

續(xù)表

醛類閾值大多較低,是肉類風(fēng)味的主要成分之一,主要來源于脂肪的氧化降解和斯特雷克氨基酸反應(yīng)[30]。醬牛肉中檢出的醛類物質(zhì)有己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、大茴香醛、十六醛、肉豆蔻醛等,己醛是亞油酸的主要氧化產(chǎn)物[31],苯甲醛是苯丙氨酸降解產(chǎn)物[32],大茴香醛、肉豆蔻醛可能來源于八角茴香、小茴香等物質(zhì)中。醇類來源于脂肪的氧化降解,其飽和醇由于閾值高,對醬牛肉風(fēng)味貢獻(xiàn)較小,而不飽和醇由于閾值低,對風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[33];醬牛肉中檢出的桉葉油醇、4-萜烯醇、α-松油醇,具有樟腦般清涼香味、胡椒香味、丁香花味,是重要的風(fēng)味貢獻(xiàn)物質(zhì)。酮類是脂肪氧化降解的另一重要產(chǎn)物,對肉風(fēng)味形成極為重要,其中3-羥基-2-丁酮具有令人愉快的奶香味[34]。

醚類主要來源于香辛料,檢出的茴香腦、草蒿腦可能來自于添加的八角茴香、小茴香、大茴香等物質(zhì),其賦予醬牛肉愉快的香氣和醇厚感[35-36]。酯類、酸類是脂肪酸和醇縮合、脂肪氧化降解形成的,由于閾值較高,因此對醬牛肉風(fēng)味貢獻(xiàn)不大,但它們是一些雜環(huán)化合物形成的重要中間體,具有不可忽視的基底作用[37]。烴類主要來源于脂肪酸烷氧基的均裂和脂肪降解,分為飽和烴和不飽和烴,飽和烴閾值較高,對風(fēng)味影響不大,不飽和烴閾值較低,對風(fēng)味影響較大;如醬牛肉中檢出了不飽和烴甲苯[38]。含氮含硫及雜環(huán)化合物閾值較低,是肉品中最重要的風(fēng)味物質(zhì),主要通過美拉德反應(yīng),氨基酸和硫胺素?zé)峤馍?其呋喃類物質(zhì)是最豐富的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物,如醬牛肉中檢出的2-戊基呋喃、4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮,具有肉品的烘烤味和堅果味[39-40]。

3 結(jié)論

本實驗基于HS-SPME-GC-MS方法,對北京稻香村醬牛肉中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化并對其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究。通過優(yōu)化,頂空固相微萃取的條件為:選取65 μm PDMS/DVB萃取頭,在樣品質(zhì)量2.0 g,萃取溫度70 ℃,萃取時間45 min,解析溫度240 ℃,解析時間為2 min時,萃取效果較好,得到總峰面積1.46×108,風(fēng)味物質(zhì)種類為44種,實際總峰面積與理論預(yù)測總峰面積相比,其相對誤差為1.37%,說明響應(yīng)面法對萃取條件的優(yōu)化具有可行性。共檢測到醛類、醇類、酮類、醚類、酯類、酸類、烴類、含氮含硫及雜環(huán)化合物8類物質(zhì),其中醛類、含氮含硫及雜環(huán)化合物的相對含量較高,分別為51.29%±2.80%和16.78%±1.10%,且閾值低,是北京稻香村醬牛肉中主要的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),對其風(fēng)味貢獻(xiàn)較大。