四環(huán)素抗納米細(xì)菌治療對泌尿系結(jié)石患者HK－2細(xì)胞損傷及結(jié)晶滯留的影響＊

申茂磊，王勤章，鄭麗英，錢 成，李 朋，錢 彪

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病之一［1－3］，由多種因素共同作用所致［4］，納米細(xì)菌（nanobacteria，NB）感染被認(rèn)為是導(dǎo)致結(jié)石形成的主要原因之一［5］，其在腎結(jié)石患者的血液、尿液和結(jié)石中的陽性檢出率均在 90%以上［6－8］。有研究者通過檢測過氧化氫酶等損傷指標(biāo)發(fā)現(xiàn)NB可以造成與其共同培養(yǎng)的HK－2細(xì)胞損傷，又通過觀察HK－2細(xì)胞與COM晶體的黏附情況發(fā)現(xiàn)被NB損傷細(xì)胞的晶體黏附性明顯增加［9］。然而由于NB的自我礦化特性，以至于眾多的抗生素都對其無效，但是四環(huán)素能沉積在納米細(xì)菌鈣化的外殼上并穿透外殼發(fā)揮抗菌作用［10］，是為數(shù)不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一。有研究者通過口服四環(huán)素片治療NB所致的Ⅲ型前列腺炎，發(fā)現(xiàn)83.3%的患者癥狀得到改善，表明四環(huán)素可能通過抗NB治療慢性前列腺炎［11］。但是四環(huán)素能否通過抗NB治療影響HK－2損傷及結(jié)晶滯留，從而達(dá)到預(yù)防以及治療NB所致腎結(jié)石的目的，不得而知。該研究首先用臨床確診腎結(jié)石且未應(yīng)用藥物或手術(shù)治療患者的尿液培養(yǎng)NB，然后通過對NB、四環(huán)素等與HK－2細(xì)胞共培養(yǎng)，應(yīng)用電鏡和共聚焦顯微鏡觀察HK－2細(xì)胞的損傷以及晶體滯留情況，探討四環(huán)素抗NB治療對HK－2損傷及結(jié)晶滯留的影響，以期為泌尿系結(jié)石的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 實驗材料 HK－2細(xì)胞（購自武漢大學(xué)保藏中心），DMEM培養(yǎng)基，1640培養(yǎng)基，胎牛血清，HEPES緩沖液，四環(huán)素，細(xì)胞孵育箱，透射電子顯微鏡，激光掃描共聚焦顯微鏡。

1.2 實驗方法 收集臨床確診腎結(jié)石且未應(yīng)用藥物或手術(shù)治療患者的尿液，具體培養(yǎng)鑒定方法參照褚浩等［12］文章。將HK－2細(xì)胞隨機分為3組，分別為NB組、四環(huán)素組和空白對照組，NB組、四環(huán)素組將人腎小管HK－2上皮細(xì)胞分別與NB、四環(huán)素和NB混合物共培養(yǎng)6 h、12 h和24 h，空白對照組只加入培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h、12 h和24 h。

1.2.1 透射電子顯微鏡觀察 分別于6 h、12 h、24 h提取各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將提取好的懸液離心后轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，PBS浸泡10 min后棄掉上清；用預(yù)冷的3%戊二醛固定2 h，PBS緩沖液洗2次，3 min/次；再加入1%鋨酸固定2 h，PBS緩沖液洗2次，同樣洗3 min/次；梯度乙醇脫水，經(jīng)比例為1∶1的Epon812和環(huán)氧丙烷浸透，包埋后在80℃恒溫條件下聚合過夜，最后進(jìn)行超薄切片、染色，于40透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.2 激光共聚焦顯微鏡檢測晶體滯留實驗 將HK－2細(xì)胞接種于鋪有清潔蓋玻片的24孔板內(nèi)，共同培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后取出各組樣本，加入COM懸液 （每孔內(nèi) COM 濃度200 mg/L），輕搖 5～10 s，COM晶體平鋪于底部，使HK－2細(xì)胞與COM晶體充分接觸。靜置3 min，將蓋玻片上方液體吸凈，加入飽和草酸鈉溶液漂洗3次。將蓋玻片從孔板中取出，經(jīng)多聚甲醛固定、PBS洗后，再加入5 mg/L的phalloidin－FITC50 μl，室溫避光條件下孵育 20 min；PBS緩沖液洗2次后，利用甘油封片。在488 nm和633 nm激發(fā)光下逐一觀察各組玻片并進(jìn)行圖像采集。

2 結(jié)果

2.1 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果 12 h空白組HK－2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整正常（圖A），膜外微絨毛數(shù)量豐富，排列規(guī)則，雙層核膜結(jié)構(gòu)正常，核周隙正常，線粒體形態(tài)正常，線粒體脊排列規(guī)則有序，未見腫脹或萎縮 （圖B），NB組 HK－2細(xì)胞膜局部區(qū)域結(jié)構(gòu)破損（圖C），微絨毛結(jié)構(gòu)稍紊亂，局部絨毛消失，細(xì)胞核畸形，細(xì)胞核外形不規(guī)則，呈雙核或兩分葉，部分線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹（圖D），四環(huán)素組HK－2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整（圖E），微絨毛結(jié)構(gòu)稍紊亂，局部絨毛消失，部分線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹（圖F）；24 h空白組HK－2細(xì)胞各種結(jié)構(gòu)如前所述（圖ab），NB組HK－2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破損，胞核裸露在外（圖c），微絨毛基本消失，線粒體數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)腫脹（圖d），四環(huán)素組HK－2細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整（圖e），微絨毛結(jié)構(gòu)稍紊亂，局部絨毛消失，部分線粒體結(jié)構(gòu)腫脹不明顯（圖f）。

圖1 12 h、24 h各組HK-2細(xì)胞透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果 如圖2所示，培養(yǎng)6 h時，NB組可觀察到少量晶體黏附，并且隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞晶體黏附量進(jìn)一步增加（圖B、E、H）；在 6 h、12 h 和 24 h 三個時間點，四環(huán)素干擾組中雖然有晶體黏附，但晶體黏附量均顯著少于NB組（圖C、F、I）；而空白組中三個時間點均未觀察到晶體黏附（圖 A、D、G）。

圖2 6 h、12 h、24 h各組激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果圖片

3 討論

以往眾多研究表明，泌尿系結(jié)石的形成可能與雌激素、骨橋蛋白等有密切聯(lián)系［13，14］，但其發(fā)病機制仍不明確。近年來，多篇文獻(xiàn)報道NB在腎結(jié)石形成過程中具有關(guān)鍵性的作用［15］。NB廣泛存在于人體血液、尿液及組織器官中，與體內(nèi)多種病理性鈣化過程密切相關(guān)［16］。 Garcia 等［17］通過經(jīng)皮腎臟注射NB建立大鼠腎結(jié)石模型，解剖發(fā)現(xiàn)腎小管廣泛鈣化，提出NB是形成結(jié)石的主要原因。賈宏偉等［18］通過大鼠尾靜脈注射NB，8 W后大鼠遠(yuǎn)曲小管和近曲小管管腔出現(xiàn)不規(guī)則結(jié)晶體。

四環(huán)素可以穿透NB的鈣質(zhì)外殼從而發(fā)揮抗菌作用。有文獻(xiàn)報道，四環(huán)素在治療NB相關(guān)的慢性前列腺炎［19］、間質(zhì)性膀胱炎［20］等方面均取得了不錯的效果。胡衛(wèi)國等［6］通過尾靜脈注射NB建立大鼠腎結(jié)石模型，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素灌胃可以減少大鼠24 h尿LDH以及腎小管結(jié)晶數(shù)，推測四環(huán)素可能有抑制腎結(jié)石形成的作用。

該實驗通過HK－2細(xì)胞分別與各組作用物共培養(yǎng)，通過電鏡及共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)NB可以引起HK－2細(xì)胞的損傷并導(dǎo)致結(jié)晶滯留，隨著共培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞損傷程度和晶體黏附量進(jìn)一步增加。這與既往研究結(jié)果一致，Xin等［9］從腎結(jié)石患者血液中提取NB，并與人腎小管上皮細(xì)胞HK－2共培養(yǎng)，建立體外模型，發(fā)現(xiàn)NB通過脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對HK－2細(xì)胞造成損傷。細(xì)胞損傷是引起結(jié)石的關(guān)鍵因素，腎小管上皮細(xì)胞損傷脫落后暴露的基底膜可以吸引結(jié)晶的黏附，而壞死的細(xì)胞碎片會進(jìn)一步富集參與形成結(jié)石，從而導(dǎo)致腎結(jié)石的發(fā)生發(fā)展［21，22］。 在 6 h、12 h 和 24 h 三個時間點，四環(huán)素干擾組中HK－2損傷程度及晶體黏附量均顯著小于NB組，表明四環(huán)素可以抑制NB對HK－2細(xì)胞的損傷并減少損傷后的晶體滯留。這一結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了四環(huán)素在腎結(jié)石的預(yù)防和治療方面的有效性，對于該病在臨床上的診治具有積極的意義。

綜上所述，NB可損傷HK－2細(xì)胞，損傷程度和晶體滯留程度與NB作用時間成正比，四環(huán)素可以抑制這一過程。因此，NB可能通過以下途徑導(dǎo)致腎結(jié)石的形成：NB感染損傷腎小管上皮細(xì)胞后，晶體向暴露的基底膜黏附，與NB和壞死細(xì)胞碎片共同形成結(jié)石。因此運用四環(huán)素或其他抗菌藥物滅殺NB可能是預(yù)防和治療結(jié)石的一個新的方向。