虎杖苷對(duì)體外培養(yǎng)人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞增殖的影響

萬(wàn)金蘭

翼狀胬肉為一種常見的眼科疾病，目前主要治療以手術(shù)切除為主或術(shù)中聯(lián)合應(yīng)用抗增殖藥治療。有研究表明，角膜表面和結(jié)膜下翼狀胬肉組織殘留是手術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因［1］，手術(shù)可能為一種刺激因素，當(dāng)病變組織中的成纖維細(xì)胞大量增殖伴發(fā)病理表現(xiàn)則在臨床復(fù)發(fā)?；⒄溶眨?，4’，5－三羥基二苯乙烯－3－β－單－D－葡萄糖苷）是從蓼科植物虎杖的干燥根莖中提取的有效成分，具有抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、改善糖脂代謝、臟器保護(hù)以及心血管疾病治療作用［2］。該研究以人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞為材料，通過(guò)檢測(cè)虎杖苷對(duì)人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞（human pterygium fibroblasts，HPF）增殖的影響，旨在為抗復(fù)發(fā)治療翼狀胬肉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 虎杖苷（南京青澤醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，批號(hào)：20141106，純度≥98%），RPMI1640 培養(yǎng)液、胎牛血清 （Gibco公司），四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT），二甲基亞砜（DMSO），PBS 液，胰蛋白酶，EDTA，青霉素，鏈霉素均來(lái)自Sigma公司；小鼠抗人角蛋白及波形蛋白單克隆抗體、小鼠抗人PCNA單克隆抗體和羊抗鼠IgG為武漢博士德公司產(chǎn)品。恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，DG－3022A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.2 方 法

1.2.1 PFB的體外培養(yǎng)、純化及鑒定 選取自筆者所在醫(yī)院行翼狀胬肉手術(shù)中切除的胬肉組織，將組織塊接種于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，加入含20%胎牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)液，在37℃、體積5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，換液1次/3～4 d。待瓶底長(zhǎng)滿70%～80%細(xì)胞后按1∶3傳代。選取第3～4代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。制作細(xì)胞玻片，采用SP法染色鑒定細(xì)胞。

1.2.2 MTT檢測(cè)虎杖苷對(duì)細(xì)胞增殖的影響 按1×104/ml將消化好的第3代成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板內(nèi)，共設(shè)4組，每組設(shè)復(fù)孔4孔，培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后加藥。虎杖苷設(shè)陰性對(duì)照組、10－2mol/L、10－3mol/L 和 10－4mol/L 組，用來(lái)調(diào)零的為空白對(duì)照組。分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h，48 h和72 h。吸去上清液，每孔加入 MTT 20μl，孵育 4 h，加 120μl DMSO 后震蕩，各孔490 nm波長(zhǎng)處吸光度值（A值）通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)虎杖苷對(duì)PCNA表達(dá)的影響

6 孔板細(xì)胞玻片制作好后用 10－2mol/L、10－3mol/L 和10－4mol/L的虎杖苷作用48 h，對(duì)照組不加藥。PCNA的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)SABC法染色檢測(cè)。隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞（放大倍率×200），對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞及陰性細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計(jì)算。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率取平均值。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞抑制率（%）=（陰性對(duì)照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值）/陰性對(duì)照組A值×100%（A值均取平均值）。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞周期 將細(xì)胞消化、同步化、分組培養(yǎng)同前。先用0.25%胰酶消化和收集細(xì)胞，再用體積比為70%乙醇溶液重懸并固定細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 翼狀胬肉成纖維細(xì)胞免疫組織化學(xué)鑒定 組織塊接種培養(yǎng)4～5 d后，細(xì)胞呈星芒狀生長(zhǎng)，且大部分細(xì)胞以梭形為主，同時(shí)夾有圓形或多角形細(xì)胞；2 W后，呈灶狀或片狀，細(xì)胞與細(xì)胞間連接成網(wǎng)狀。傳代至3代后，基本為梭形，生長(zhǎng)加快。HE染色后見細(xì)胞呈現(xiàn)梭形，均胞質(zhì)，淡紅色，胞質(zhì)有突起，核藍(lán)染，橢圓形，染色質(zhì)均勻，核仁不明顯（圖1）。細(xì)胞培養(yǎng)后經(jīng)鑒定波形蛋白染色陽(yáng)性，存在于胞漿，與細(xì)胞長(zhǎng)軸方向平行，呈棕黃色束狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖2）；空白對(duì)照未見棕色顆粒（圖 3）。

圖1 人翼狀胬肉組織的培養(yǎng)細(xì)胞HE染色呈陽(yáng)性（×100）

圖2 波形蛋白陽(yáng)性染色呈均勻一致的棕色顆粒，細(xì)胞呈梭形（×100）

圖3 陰性對(duì)照無(wú)棕色顆粒出現(xiàn)（×100）

2.2 虎杖苷對(duì)HPF增殖的影響 不同藥物濃度組對(duì)細(xì)胞形態(tài)作用不同，高濃度組（10－2mol/L）細(xì)胞數(shù)量減少，呈不規(guī)則形且折光性降低，胞質(zhì)中可見顆粒樣物質(zhì)；10－3mol/L 濃度組變化不明顯；10－4mol/L濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。成纖維細(xì)胞給予不同濃度虎杖苷干預(yù)24 h，48 h和72 h后，采用t檢驗(yàn)分別比較各作用時(shí)間點(diǎn)及濃度組與對(duì)照組細(xì)胞A值的差值，不同時(shí)間點(diǎn)各濃度組與對(duì)照組細(xì)胞A值的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表 1。

表1 虎杖苷不同時(shí)點(diǎn)對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 虎杖苷不同時(shí)點(diǎn)對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的影響（±s）

組別 24 h 48 h 72 h A值 抑制率（%） A值 抑制率（%） A值 抑制率（%）對(duì)照組 0.514±0.021 0 0.618±0.176 0 0.671±0.198 0 10－2 mol/L 組 0.145±0.047 71.79 0.157±0.046 74.60 0.166±0.051 75.26 10－3 mol/L 組 0.441±0.098 14.2 0.596±0.183 3.56 0.667±0.217 0.6 10－4 mol/L 組 0.579±0.121 －12.65 0.697±0.213 －12.78 0.774±0.245 －15.35

2.3 免疫組化檢測(cè)虎杖苷對(duì)HPF表達(dá)PCNA的影響 細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色、黃色或淺黃色均勻細(xì)小顆粒為陽(yáng)性；細(xì)胞核無(wú)變化，胞質(zhì)呈淡黃色為陰性。10－2mol/L 虎杖苷抑制 HPF 表達(dá) PCNA，10－4mol/L虎杖苷促進(jìn) HPF表達(dá) PCNA（P＜0.05），詳見表 2。

表2 不同濃度虎杖苷對(duì)HPF表達(dá)PCNA的影響

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各細(xì)胞周期情況 虎杖苷對(duì)細(xì)胞周期的影響，10－2mol/L組細(xì)胞停滯于G1期；10－3mol/L組G1期細(xì)胞數(shù)減少，S期細(xì)胞數(shù)增加；與對(duì)照組比較差異有顯著性意義（P＜0.05），見表3。

表3 不同濃度虎杖苷對(duì)成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響（x±s）

3 討論

翼狀胬肉是一種向角膜表面生長(zhǎng)與結(jié)膜相連的纖維血管樣組織，以鼻側(cè)瞼裂區(qū)多見。翼狀胬肉含有大量新生的血管纖維組織，具有較強(qiáng)的侵襲性，向角膜緣生長(zhǎng)，角膜前彈力層被玻璃樣或彈性組織所代替，角膜正常結(jié)構(gòu)被破壞；向角膜內(nèi)呈進(jìn)行性侵入生長(zhǎng)，具有腫瘤樣特性，故認(rèn)為是一種腫瘤樣病變［3］。外界各種刺激作用使結(jié)膜下膠原纖維發(fā)生變性，同時(shí)角膜前彈力層受損致角膜上皮變性，結(jié)締組織長(zhǎng)入已變性的角膜組織中形成胬肉。本病發(fā)病與環(huán)境密切相關(guān)，如陽(yáng)光、沙塵等各種慢性刺激，日光中的紫外線是引起翼狀胬肉的重要原因。近期已通過(guò)細(xì)胞分子生物技術(shù)，證明了其發(fā)生機(jī)制涉及基因成分、抗凋亡機(jī)制、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、免疫和病毒感染等［4］。病理學(xué)研究表明成纖維細(xì)胞在翼狀胬肉的形成過(guò)程中起重要作用，因此，尋找抑制成纖維細(xì)胞增殖的藥物非常重要。以往研究表明，在翼狀胬肉發(fā)生過(guò)程中，細(xì)胞凋亡失控而不及增殖，導(dǎo)致結(jié)膜纖維組織及新生血管過(guò)度增殖。增殖與凋亡的細(xì)胞調(diào)節(jié)基因參與了翼狀胬肉組織的異常增殖。促進(jìn)凋亡基因表達(dá)較抑制凋亡基因表達(dá)增強(qiáng)細(xì)導(dǎo)致胞凋亡。蘭榕等［5］檢出初發(fā)及復(fù)發(fā)性翼狀胬肉中Bcl－2的表達(dá)，翼狀胬肉中Bcl－2的表達(dá)較正常球結(jié)膜顯著增高，復(fù)發(fā)性翼狀胬肉中Bcl－2表達(dá)高于初發(fā)性翼狀胬肉，可見Bcl－2在翼狀胬肉增殖及復(fù)發(fā)中非常重要。

以往抗纖維化、抗增殖作用的藥物主要為抗腫瘤藥物如5－氟尿嘧啶、絲裂霉素等，這些藥物在抗增殖的同時(shí)對(duì)正常組織不良反應(yīng)大，因此臨床應(yīng)用受限制。近期有研究表明虎杖苷有抗纖維增生的作用，據(jù)報(bào)道，10－2mol/L虎杖苷對(duì)成纖維細(xì)胞有促凋亡作用［6］，對(duì)正常細(xì)胞的毒性較小。 虎杖苷（polydatin，PD）又名白藜蘆醇苷，近年研究［7，8］發(fā)現(xiàn)，虎杖苷可有效地抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，對(duì)正常細(xì)胞毒性較小?；⒄溶湛蓽p少心肌缺血/再灌注后線粒體結(jié)構(gòu)的破壞，抑制心肌細(xì)胞凋亡，降低凋亡率；增加心肌 B 細(xì)胞淋巴瘤－2（B cell lymphoma－2，Bcl－2）蛋白的表達(dá)及 Bcl－2/Bax 的比值［9］。

該研究采用了體外細(xì)胞培養(yǎng)的方法觀察了不同濃度組虎杖苷對(duì)成纖維細(xì)胞增殖的作用，10－2mol/L濃度組 HPF表達(dá) PCNA細(xì)胞數(shù)減少，10－2mol/L濃度組有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，10－3mol/L濃度組作用不明顯，相反10－4mol/L濃度組可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，在虎杖苷作用24 h后即可觀察到細(xì)胞變化，因此，不同的用途對(duì)于濃度的選擇非常重要。另外，10－2mol/L為最合適的濃度，其抗增殖機(jī)制有待進(jìn)一步研究。