低頻電磁場模擬腦電節(jié)律儀對SD大鼠腦含水量及外周血IL－6和TNF－α的影響＊

郭紅燕，張金濤，李乃義，王鳳嬌，劉勝松

低頻電磁場模擬腦電節(jié)律儀，是筆者所在醫(yī)院自主研制并獲得國家專利（國家實用新型專利公開號：CN201320347）的儀器。此儀器采用低頻電磁場輻射方式進行設(shè)計，通過模擬腦電節(jié)律的電磁場對腦進行刺激，是治療神經(jīng)、心理、精神疾病的新手段［1］，用于治療軍人心理應(yīng)激反應(yīng)效果顯著［2］。 為進一步驗證其應(yīng)用安全性，該研究采用腦電節(jié)律儀干預(yù)正常SD大鼠后，觀察其對腦水腫和外周血IL－6、TNF－α的表達的影響。

1 材料與方法

1．1 一般資料

1.1.1 實驗動物及分組 購于北京維通利華實驗動物技術(shù)公司的SD大鼠60只，雌雄各30只，健康清潔級，8 周齡，體重（230±20） g，控制動物房 12 h白黑交替，溫度為（23±2）℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 W。先將正常SD大鼠隨機分為四組，每組15只，實驗組在每日固定時間進行干預(yù)，發(fā)射源固定于清醒態(tài)大鼠顱頂骨外約2 cm處，1次/d，每次0.5 h，分別為正常對照組（A組），每日置于相同的固定裝置內(nèi)不予以治療；1 HZ 組 （B 組）；10 HZ 組（C 組）；20 HZ 組 （D組），每日均在固定時間干預(yù)，30 min/d，連續(xù)7 d。

1.1.2 實驗試劑及設(shè)備 酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（IL－6購于南京建成生物工程研究所、TNF－α購于依科賽生物科技有限公司）、低頻電磁場模擬腦電節(jié)律儀（解放軍第八十八醫(yī)院）、臺式冷凍高速離心機（德國 Eppendorf 5810R）、電恒溫烤箱（江蘇太倉市實驗廠）、全自動酶標(biāo)儀 （美國Biotek ELX800UV）、全自動洗板機 （美國 Biotek ELX50/6）、超純水系統(tǒng)（英國 Elga Puelab Bioscien）、漩渦混勻儀（美國 SCI Vortex）、超低溫冰箱（－80 ℃，丹麥 Heo－Holten 3410）、單通道精密移液器 （德國Eppendorf Research）。

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)本采集 干預(yù)結(jié)束后進行標(biāo)本采集，在室溫25℃條件下，用10%水合氯醛0.4 ml/100 g行腹腔麻醉注射。麻醉成功后，大鼠仰臥固定四肢，在胸骨左側(cè)心臟搏動最強點穿刺，用抗凝采血管抽血約5 ml，混勻后高速離心機3000轉(zhuǎn)/min離心10 min后取上清液，分裝于離心管內(nèi)，凍存于－80℃冰箱留待批量指標(biāo)檢測，采血完成后快速從上頸椎處剪斷頸髓，剪除顱骨小心剝離腦膜，從延髓開始分離輕輕取出整腦，稱腦濕重。置于100℃烤箱烤24 h，稱腦干重。

1.2.2 腦組織含水量測定 大鼠麻醉后迅速斷頭取腦。用濾紙吸除腦組織表面的水分，電子分析天平（精確至0.001 g）稱取濕重（W），再將腦組織置于100℃的恒溫干燥箱烘烤24 h稱取其干重（D）。應(yīng)用Elliot公式計算腦組織的含水量：腦組織含水量（%）（BWC）=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.2.3 血清學(xué)ELISA指標(biāo)檢測 （1）室溫解凍血清標(biāo)本后備用。（2）自試劑盒中取出所需酶標(biāo)板條，室溫復(fù)溫30 min，將剩余板條密封放回4℃冰箱保存。（3）標(biāo)準(zhǔn)品的配置：1、2、3、4、5 號 IL－6 標(biāo)準(zhǔn)品依次為 5 ng/L、10 ng/L、20 ng/L、40 ng/L、80 ng/L。1、2、3、4、5、6、7、8 號 TNF－α 標(biāo)準(zhǔn)品依次為 0 pg/ml、31.25 pg/ml、62.5 pg/ml、125 pg/ml、250 pg/ml、500 pg/ml、1000pg/mL、2000pg/mL。 （4）設(shè)置好樣本孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白孔，做復(fù)孔。（5）加樣：①空白孔不加樣品、生物素標(biāo)記的抗 IL－6（TNF－α）抗體、鏈霉親和素－HRP，只加顯色劑和終止液，其余各部操作相同；②標(biāo)準(zhǔn)品孔加標(biāo)準(zhǔn)品50μl、鏈霉親和素－HRP50μl；③樣本孔先加待測樣本40μl，再加生物素標(biāo)記的抗 IL－6（TNF－－α）抗體 10 μl、鏈霉親和素－HRP50μl， 蓋上封板膜，IL－6在 37℃恒溫箱溫育 60 min（TNF－α 室溫 120 min）。 （6）配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋成20×應(yīng)用液，備用。（7）洗滌：到時間后，棄去孔內(nèi)液體，并用吸水紙吸干，入洗板機重復(fù)洗板5次，拍干。（8）顯色：每孔顯色劑A、B各 50 μl，混勻，37℃避光孵育 10 min。（9）終止：各孔加入終止液50μl，終止反應(yīng) （此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。（10）測定：以空白孔調(diào)零，終止反應(yīng)10 min內(nèi)

測定，450 nm波長通過酶標(biāo)儀測定各孔的OD值。（11）實驗結(jié)果計算：以酶標(biāo)孔中標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值通過作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（X軸為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，Y軸為相應(yīng)的吸光度值），并根據(jù)樣品吸光度值在該曲線圖上分別求得相應(yīng)的大鼠血清學(xué)IL－6與TNF－α的濃度。

1.2.4 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（F檢驗）。均數(shù)兩兩比較采用LSD法 （最小顯著差異法），P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物一般情況分析 整個實驗過程，無動物傷亡事件，精神飲食均正常，活動正常，大小便正常，實驗組與正常對照組的大鼠體重均呈持續(xù)增長狀態(tài)。

2.2 IL-6的ELISA檢測結(jié)果 正常對照組在血清中含量較低；各實驗組中含量表達無明顯變化，與正常對照組比較（P=0.999），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 大鼠外周血IL-6的表達（濃度）結(jié)果

2.3 TNF-α的ELISA檢測結(jié)果 正常對照組在血清中含量較低；實驗組中含量表達無明顯變化，與對照組比較（P=0.935），差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 大鼠外周血TNF-α的表達（濃度）結(jié)果

2.4 干預(yù)后大鼠腦組織的干濕重變化 A組、B組、C組、D組大鼠腦組織含水量分別為77.45±0.009、77.58±0.008、77.54±0.009、77.65±0.009 （P＞0.05），組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 大鼠腦含水量的表達結(jié)果

3 討論

腦電節(jié)律儀在治療精神疾病方面具有一定的應(yīng)用價值，其原理主要是：通過誘導(dǎo)使大腦的兩半球進入一種同步的狀態(tài)（brain sync），即腦波同步狀態(tài)，并誘發(fā)人腦產(chǎn)生α、β、θ、δ頻率的腦電波，這幾種腦電波與人的精神狀態(tài)有著至關(guān)重要的聯(lián)系［1］。目前，通常采用的誘導(dǎo)方式主要是通過聲光刺激與低頻電脈沖刺激；與之不同，筆者研制的腦電節(jié)律同步調(diào)節(jié)儀主要采用了低頻電磁場輻射方式，通過人工制造的腦電節(jié)律電磁場對人體腦部進行刺激誘導(dǎo)［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)顱磁刺激可以改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的抑郁行為及海馬神經(jīng)元的凋亡［3］，并對可促進腦梗死后空間學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)［4］；筆者之前通過水迷宮數(shù)據(jù)的變化研究也發(fā)現(xiàn)，采用模擬腦電節(jié)律儀的低頻電磁場對正常大鼠的認知功能無不良影響，可能有改善作用［5］。

近年研究表明腦組織的損傷與炎癥反應(yīng)相關(guān)［3，4］。IL－6、TNF－α為促炎癥性細胞因子，主要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，參與免疫細胞發(fā)育、刺激造血、介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及參與組織修復(fù)等。IL－6是具有促進生長和分化等調(diào)節(jié)功能的炎癥細胞因子，主要生物學(xué)功能是作為細胞分化因子，促進各類免疫細胞和造血細胞的分化、增殖，并介導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)。在機體生理或病理條件下都發(fā)揮重要作用，不僅作用于免疫系統(tǒng)，還廣泛作用于神經(jīng)［5］、內(nèi)分泌和心血管等系統(tǒng)。脈絡(luò)叢室管膜細胞、血管內(nèi)皮細胞、星形細胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元等中樞神經(jīng)細胞在不同損傷或刺激下可產(chǎn)生IL－6。大量的資料表明，在正常情況下腦內(nèi)IL－6僅有低水平表達，腦損傷后表達明顯增加。在腦損傷的早期IL－6水平明顯增高，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥與腦水腫的發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)元的退變和丟失以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫方面起著重要作用，而晚期IL－6水平再次升高，促進了腦組織的再生和修復(fù)，并可誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮細胞增生和血管的形成［6］。目前研究表明IL－6的作用可能通過以下機制：IL－6 與其受體（IL－6Ra）結(jié)合后，識別信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分gp130，三者共同形成生物活性的三元復(fù)合體，該復(fù)合體激活細胞內(nèi)的多種激酶，導(dǎo)致蛋白磷酸化和基因表達，進而發(fā)揮生物學(xué)作用。腦損傷后，不同實驗動物腦組織、腦脊液和血清中均可以檢測到IL－6 和 IL－6 受體水平升高［7］。 IL－6 水平增高可以出現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷及感染性病患中。在顱腦損傷早期神經(jīng)膠質(zhì)細胞可以產(chǎn)生IL－6等細胞因子，使神經(jīng)系統(tǒng)及外周血中IL－6的含量顯著增高［8］。

TNF－α是被激活的巨噬細胞分泌的一種前炎癥細胞因子，是炎癥反應(yīng)重要的起始因子之一。TNF－α可在全身發(fā)揮作用，具有廣泛而復(fù)雜的生物學(xué)活性，釋放增加引起多核白細胞激活聚集并釋放炎癥介質(zhì)，誘導(dǎo)缺血神經(jīng)元壞死和凋亡。TNF－α細胞來源極為廣泛，各種免疫細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞、角質(zhì)細胞、平滑肌細胞以及急性腦缺血后的小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元等均可分泌TNF－α。TNF－α作為致炎因子通過誘發(fā)和促進炎癥、細胞毒性、凝血等多種凋亡途徑加劇缺血損傷［9］。損傷后TNF－α快速升高，具有神經(jīng)毒性作用，加速神經(jīng)死亡。TNF－α還加重腦水腫，損傷血腦屏障，促進趨化因子的生成，誘導(dǎo)白細胞聚集，產(chǎn)生大量的有害物質(zhì)。動物實驗表明［10］，腦損傷發(fā)生后，血漿及腦組織 TNF－α、IL－6含量均出現(xiàn)變化。細胞因子 IL－1β，TNF－α，IL－6，IL－8 等通過炎癥細胞的活化，使血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的通透性增加［11］。TNF－α早期主要通過對毛細血管的直接毒性作用，使毛細血管的通透性增加，開放BBB，導(dǎo)致腦水腫。

既往研究表明，經(jīng)顱磁刺激能利用時變磁場產(chǎn)生感應(yīng)電場，引起生物電流在組織中傳導(dǎo)，使得神經(jīng)纖維、神經(jīng)元和肌肉去極化，用以改變皮質(zhì)神經(jīng)細胞的動作電位，影響腦內(nèi)代謝和神經(jīng)電活動［12，13］。經(jīng)顱磁刺激治療廣泛性焦慮障礙的療效顯著［14］；趙琳等研究經(jīng)顱磁刺激可以改善慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠的抑郁行為及海馬神經(jīng)元的凋亡［15］。張靖慧等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)顱磁刺激對可促進腦梗死后空間學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)，并可能通過增加患側(cè)海馬區(qū)IL－1βmRNA表達來實現(xiàn)［16］。而經(jīng)顱磁刺激對正常大鼠周圍血TNF－α、IL－6的影響鮮有報道。筆者所在醫(yī)院自主研制的腦電節(jié)律儀其作用機制是：采用低頻電磁場方式制造的腦電節(jié)律對腦部進行刺激，利用反饋原理起安眠、精神松弛等治療效果，為治療精神疾病及心理疾病提供了新手段，而且不存在藥物依賴及不良作用。

該研究進一步通過干預(yù)正常大鼠，觀察了該節(jié)律儀所采用低頻電磁場對腦含水量及外周血白介素－6、TNF－α的影響。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，實驗組在每日固定時間，1次/d，30 min/次，連續(xù)7 d進行低頻電磁場輻射后，1 HZ組 （B組）；10 HZ組（C組）；20 HZ組（D組）大鼠腦組織含水量組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；正常對照組在血清中IL－6、TNF－α含量均較低；低頻電磁場輻射1周后各實驗組中含量表達無明顯變化，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明腦電節(jié)律儀對正常大鼠周圍血清中的TNF－α、IL－6含量無明顯影響，既沒有破壞血腦屏障導(dǎo)致腦水腫，又未啟動機體的炎癥免疫反應(yīng)，對大鼠具有安全性。該研究探討了TNF－α、IL－6因子結(jié)合腦水腫反映其安全性，但是有關(guān)確切機制和臨床還有待進一步驗證。