siRNA靶向干擾ROBO1基因表達(dá)對食管癌細(xì)胞周期、增殖及相關(guān)蛋白的影響

劉志廣 劉 芬 韓江紅

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院胸瘤一科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

EffectsofsiRNAinterferenceonROBO1geneexpressiononcellcycle,proliferationandrelatedproteinsinesophagealcarcinoma

LIUZhi-Guang,LIUFen,HANJiang-Hong.

No.1DepartmentofChestTumor,XinxiangCentralHospital,Xinxiang453000,Henan,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effect of siRNA targeting interference roundabout, axon guidance receptor, homoloh 1(ROBO1) gene expression on proliferation and cell cycle of esophageal cancer EC109 cells and its possible mechanism.MethodsEsophageal cancer EC109 cells were randomly divided into blank group, control group and SiRNA-ROBO1 group. Negative siRNA and siRNA-ROBO1 were transfected into EC109 cells by liposome. The expression of ROBO1, nuclear related antigen Ki-67(Ki-67), proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and CyclinD1 protein were detected by Western blot. The proliferation activity of the cells was detected by CCK-8 assay and the cell cycle changes of EC109 were detected by flow cytometry.ResultsAfter interfering with ROBO1 expression, the expression of ROBO1 protein in EC109 cells was significantly lower than that in the blank group(P<0.05), and the cell proliferation activity was significantly decreased(P<0.05). The cells in G0/G1 phase were significantly increased(P<0.05), and in G2/M phase were significantly decreased(P<0.05). The expression levels of Ki-67, PCNA and CyclinD1 in siRNA-ROBO1 group were significantly lower than those in the blank group(P<0.05).ConclusionsROBO1 may inhibit the proliferation of esophageal cancer cells by affecting the proliferation and cycle-associated protein levels of esophageal cancer cells and arresting the cell cycle in G0/G1 phase.

【Keywords】 Esophageal cancer; siRNA; ROBO1; EC109

目前，國內(nèi)外對于食管癌的早期診斷和治療并未尋找到有效的方法，其五年生存率仍較低〔1〕。食管癌對人類的健康產(chǎn)生極大的危害，目前的治療手段是手術(shù)、放療、化療單獨(dú)或者聯(lián)合使用，但副作用較大，花費(fèi)高，患者的預(yù)后較差，無法從根本上阻礙腫瘤的生長，因此需要我們不斷探索、尋找新的治療手段〔2〕。隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，促進(jìn)人類對基因領(lǐng)域的相關(guān)研究，使人們可從基因水平闡釋腫瘤的發(fā)病機(jī)制?；虻淖儺?、突變、表達(dá)量的變化等對腫瘤的演進(jìn)均發(fā)揮重要作用〔3～5〕。目前，食管癌的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，所以研究食管癌的發(fā)生、發(fā)展作用機(jī)制具有重大意義，探索新的診斷標(biāo)志物以及治療的靶基因，為降低食管癌的死亡率以及發(fā)病率提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本文通過小RNA干擾技術(shù)(siRNA)干擾食管癌EC109細(xì)胞中軸突導(dǎo)向受體蛋白(ROBO)1表達(dá)，研究對EC109細(xì)胞增殖、周期及相關(guān)蛋白的影響，探索ROBO1在食管癌發(fā)生發(fā)展的作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人食管癌細(xì)胞系EC109購自美國Allcells公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清、青-鏈霉素、Opti-MEM購自美國Gibco公司，胰蛋白酶購自青島捷世康生物科技有限公司，LipofectamineTM2000試劑購自美國Invitrogen公司，siRNA、細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博公司，細(xì)胞周期檢測試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司，細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1兔抗人單克隆抗體購自美國CST公司，細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki-67(Ki-67)單克隆抗體、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin單克隆抗體購自英國Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京鼎國生物公司。細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購自德國Heraeus公司，酶標(biāo)儀購自美國BIO-RAD公司，臺式低溫高速離心機(jī)購自德國Eppendorf公司，流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng) 將人食管癌細(xì)胞EC109培養(yǎng)基于含10%胎牛血清、1% 100 U/ml青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于含有5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長濃度覆蓋培養(yǎng)瓶底約80%時，加入胰酶，顯微鏡中觀察自爆形態(tài)逐漸變?yōu)闄E圓，加入新鮮RPMI1640培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，以1∶3或1∶4的比例制成單細(xì)胞懸液，37℃常規(guī)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 選擇對數(shù)期食管癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前24 h常規(guī)消化細(xì)胞，加入無胎牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個/孔，加入24孔板中，待細(xì)胞密度至50%～70%時，將細(xì)胞分為空白組、對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA)、siRNA-ROBO1組。吸取50 μl Opti-MEM稀釋脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(2 μl/孔)，室溫靜置5 min；采用無RNA酶水將siRNA-ROBO1稀釋為2 μmol/L；將稀釋的脂質(zhì)體與siRNA-ROBO1混合均勻，室溫靜置20 min，形成脂質(zhì)體-siRNA-ROBO1轉(zhuǎn)染復(fù)合物；吸取10 μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入各孔細(xì)胞中，前后搖動混勻，置于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換為含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，Western印跡測定轉(zhuǎn)染效果。

1.4細(xì)胞增殖活力的檢測 將食管癌細(xì)胞接種至6孔板中，待細(xì)胞密度至50%～70%時，將細(xì)胞分為空白組、對照組、siRNA-ROBO1組，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法同1.3；吸取100 μl細(xì)胞懸浮液加入96孔板中，使每孔細(xì)胞密度為(1～3)×103個，每組3個復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)48 h，每孔加入10% CCK-8溶液，振蕩混勻，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.5 h，測定細(xì)胞在450 nm波長下的吸光值(OD450 nm值)。

1.5細(xì)胞周期檢測 胰酶消化轉(zhuǎn)染后48 h的食管癌細(xì)胞，加入1 ml預(yù)冷的乙醇，4℃固定過夜，棄去乙醇，PBS液洗滌，加入200 μl 1 g/L RNaseA，室溫孵育30 min，吸取500 μl PI溶液，4℃避光孵育30 min，置于流式細(xì)胞儀中檢測。

1.6Western印跡檢測細(xì)胞中Ki-67、PCNA、CyclinD1蛋白的表達(dá)水平 胰酶消化轉(zhuǎn)染后48 h食管癌細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，充分振蕩，冰上裂解15 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上層，根據(jù)BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。

清洗玻璃板、梳子、電泳裝置，晾干，配置10 ml 10%分離膠和5 ml 5%濃縮膠。將分離膠緩慢注入玻璃板，加至玻璃板上邊沿約3 cm，加入3 ml異丙醇覆蓋分離膠，室溫放置40 min，棄掉異丙醇，在分離膠上邊沿0.5 cm處緩慢注入濃縮膠，插入梳子，防止氣泡的出現(xiàn)。取30 μg蛋白樣品溶于等體積5×上樣緩沖液，100℃變性5 min。80 V電泳至溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠，調(diào)整電壓至110 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠邊緣。根據(jù)目的蛋白分子量的大小切下分離膠，組裝轉(zhuǎn)膜裝置，90 V，280 mA冰水中電泳60 min。Tris-Hcl緩沖鹽溶液+Tween(TBST)清洗轉(zhuǎn)膜后的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，加入含封閉液的平皿中，搖動封閉2 h，加入稀釋的一抗，搖床上孵育1.5 h，4℃過夜，TBST洗膜3次×10 min，加入二抗，搖床上孵育1.5 h，TBST洗膜3次×10 min，滴加化學(xué)發(fā)光試劑A液、B液，避光孵育3 min，暗室中曝光，成像儀中成像。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件資料進(jìn)行單因素方差分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1Western印跡測定轉(zhuǎn)染效果 siRNA-ROBO1組ROBO1蛋白表達(dá)量(0.249±0.036)較空白組顯著降低(P<0.05)，對照組細(xì)胞中ROBO1蛋白水平(0.795±0.078)與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1，表1。

圖1 EC109細(xì)胞轉(zhuǎn)染后ROBO1蛋白的表達(dá)量

2.2ROBO1表達(dá)量降低對食管癌細(xì)胞增殖活力的影響 siRNA-ROBO1組細(xì)胞的增殖活力(0.302±0.045)較空白組(0.758±0.073)顯著降低(P<0.05)，對照組細(xì)胞的增殖活力(0.726±0.084)與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3ROBO1表達(dá)量降低對食管癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 siRNA-ROBO1組G0/G1期細(xì)胞較空白組顯著增加(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞顯著降低(P<0.05)，S期細(xì)胞變化不明顯，對照組細(xì)胞周期與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

2.4ROBO1表達(dá)量降低對食管癌細(xì)胞中相關(guān)蛋白水平的影響 siRNA-ROBO1組PCNA、Ki-67、CyclinD1蛋白表達(dá)量較空白組顯著降低(P<0.05)，對照組細(xì)胞中PCNA、Ki-67、CyclinD1蛋白水平與空白組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖2，表2。

表1 ROBO1表達(dá)量降低對食管癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響

與空白組比較：1)P<0.05，下表同

圖2 ROBO1表達(dá)量降低對食管癌細(xì)胞中PCNA、Ki-67、CyclinD1蛋白水平的影響

組別PCNA/β-actinKi-67/β-actinCyclinD1/β-actin空白組0.628±0.0560.466±0.0450.458±0.042對照組0.619±0.0620.429±0.0630.469±0.053siRNA-ROBO1組0.230±0.0251)0.185±0.0211)0.158±0.0241)F值61.10632.60354.431P值0.0000.0010.000

3 討 論

ROBO1屬于免疫球蛋白超家族，是SLIT家族成員的跨膜受體，主要在神經(jīng)系統(tǒng)中分泌，對軸突導(dǎo)向發(fā)揮重要作用〔6～9〕。近年研究表明，ROBO1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。研究證實(shí)，ROBO1在肝癌組織中的表達(dá)量上調(diào)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞新血管形成〔10〕。在自發(fā)腸腺瘤或SLIT2轉(zhuǎn)基因小鼠模型中，ROBO1在腸道腫瘤組織中高表達(dá)，且可通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的表達(dá)激活Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生〔11〕。但是，在不同中的腫瘤組織中ROBO1發(fā)揮不同的作用。ROBO1在前列腺癌中通過與相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合間接激活鈣黏蛋白E和β-catenin信號通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞遷移〔12〕。在膽管癌中，通過免疫組化檢測膽管癌組織中ROBO1的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROBO1的表達(dá)水平與膽管癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)，且ROBO1能阻礙膽管癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力〔13〕。研究發(fā)現(xiàn)，ROBO1在食管癌中異常表達(dá)，在食管癌的發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮作用〔14〕。

本實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染siRNA-ROBO1的食管癌細(xì)胞中ROBO1蛋白的表達(dá)量明顯降低，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期發(fā)揮抑制食管癌細(xì)胞增殖的的作用。

Ki67、PCNA與腫瘤細(xì)胞的增殖密切相關(guān)。研究表明，Ki67在胃癌、肝癌及肺癌等惡性腫瘤中均高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程以及組織轉(zhuǎn)移、浸潤、預(yù)后發(fā)揮重要作用〔15～17〕。Ki67的表達(dá)量對于腫瘤細(xì)胞的增殖、有絲分裂、周期具有重要作用，可作為腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性及預(yù)后的評價指標(biāo)〔18〕。既往研究認(rèn)為，PCNA參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，在結(jié)腸癌、口腔癌、肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)〔19～22〕。PCNA是DNA復(fù)制過程中的關(guān)鍵因子，能與細(xì)胞內(nèi)多種因子結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞周期、DNA甲基化、DNA的損傷修復(fù)過程發(fā)揮多種功能。研究表明，PCNA與細(xì)胞的增殖、凋亡過程密切相關(guān)，其表達(dá)量可作為評價腫瘤惡性程度和細(xì)胞的增殖能力的指標(biāo)之一〔23〕。CyclinD1是細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)換過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在多種腫瘤中的表達(dá)量上調(diào)，其與惡性腫瘤的程度密切相關(guān)〔24〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ROBO1表達(dá)量下降抑制細(xì)胞中Ki67、PCNA、CyclinD1蛋白的表達(dá)量。因此，推測抑制ROBO1表達(dá)可能通過影響細(xì)胞增殖相關(guān)因子Ki67、PCNA以及細(xì)胞周期相關(guān)因子CyclinD1的表達(dá)降低細(xì)胞的增殖能力。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)抑制食管癌細(xì)胞中ROBO1表達(dá)，發(fā)現(xiàn)，食管癌細(xì)胞的增殖活性下降，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，表明ROBO1與促進(jìn)細(xì)胞增殖和調(diào)控細(xì)胞周期有一定關(guān)系，提示ROBO1基因在食管癌細(xì)胞中具有一定的致瘤性，其作用可能與Ki67、PCNA、CyclinD1的表達(dá)量有關(guān)。下一步將繼續(xù)在動物模型中研究ROBO1基因在食管癌中的作用，為探究食管癌的發(fā)病機(jī)制、靶向基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。