解淀粉芽孢桿菌HM618對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

龐亞琴 ，任彩婷 ，徐秋曼

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

重金屬鎘在作物體內(nèi)積累會(huì)產(chǎn)生毒害作用，嚴(yán)重阻礙其生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1].因此，如何緩解植物鎘脅迫一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).Wang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸能夠通過NO信號(hào)通路介導(dǎo)小麥幼苗對(duì)鎘脅迫的耐受性，促進(jìn)根的生長(zhǎng)并維持活性氧平衡和降低Cd吸收；Basalah等[3]發(fā)現(xiàn)NO和水楊酸能夠通過誘導(dǎo)抗氧化酶活性和促進(jìn)保護(hù)劑脯氨酸的積累，保持植物體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡、減少丙二醛（MDA）積累和光合色素的變化，減緩Cd脅迫對(duì)植物的毒害；宋敏等[4]發(fā)現(xiàn)，外源施加脯氨酸能夠使遭受鎘脅迫小麥幼苗的根長(zhǎng)、株高、干重、葉綠素和類胡蘿卜素含量恢復(fù)到對(duì)照水平，抗壞血酸、內(nèi)源游離脯氨酸含量和SOD活性上升，鎘積累量下降.微生物制劑也能夠緩解植物重金屬脅迫.解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的植物根際促生菌（PGPR），PGPR是一類定殖于植物根系、能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng)和抵抗脅迫的益生細(xì)菌.解淀粉芽孢桿菌在生長(zhǎng)過程中可產(chǎn)生具有廣泛抑制真菌和細(xì)菌活性的代謝產(chǎn)物，目前關(guān)于解淀粉芽孢桿菌的研究多圍繞這一內(nèi)容進(jìn)行[5].關(guān)于解淀粉芽孢桿菌對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用也有少量報(bào)道：如劉拴成等[6]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌可以提高玉米生長(zhǎng)和產(chǎn)量；楊曉云等[7]研究表明，解淀粉芽孢桿菌能夠增加番茄植株的葉綠素和胡蘿卜素含量并增強(qiáng)根系活力.

小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要的糧食作物之一，土壤重金屬污染嚴(yán)重威脅了小麥農(nóng)業(yè)生產(chǎn).陳淋[8]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌能夠通過調(diào)控多個(gè)基因的表達(dá)促進(jìn)植物對(duì)鹽脅迫的耐受能力，如葉綠素、光合速率、脫落酸、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化酶等.本研究以小麥幼苗為實(shí)驗(yàn)材料，將不同量的解淀粉芽孢桿菌HM618菌株發(fā)酵液作用于鎘脅迫下的小麥幼苗，分析其生長(zhǎng)和生理指標(biāo)的變化，探討解淀粉芽孢桿菌緩解小麥物重金屬鎘脅迫的效應(yīng)，為深入探究解淀粉芽孢桿菌對(duì)植物重金屬脅迫緩解效應(yīng)的生理和分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

解淀粉芽孢桿菌HM618（Bacillusamyloliquefaciens HM618，CGMCC7097），由天津大學(xué)化工學(xué)院程景勝課題組提供.

1.1.2 植物材料

小麥（Triticum aestivum L.）為“魯麥 22種子”，由天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 處理液配制和幼苗培養(yǎng)

1.2.1 處理液配制

分別取500 mL不同質(zhì)量濃度的CdCl2與不同體積的解淀粉芽孢桿菌HM618發(fā)酵液配制成12個(gè)處理組.處理組A1～A4的配方：CdCl2的質(zhì)量濃度為0 mg/L，HM618發(fā)酵液的體積分別為0、10、20、40mL；處理組B1～B4的配方：CdCl2的質(zhì)量濃度為20 mg/L，HM618發(fā)酵液的體積分別為0、10、20、40mL；處理組C1～C4的配方：CdCl2的質(zhì)量濃度為80 mg/L，HM618發(fā)酵液的體積分別為0、10、20、40 mL.

1.2.2 幼苗培養(yǎng)及處理

將小麥種子用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min，沖洗3～5次后再用蒸餾水浸種12 h.將預(yù)處理的種子腹溝向下，整齊排列在直徑為12 cm、墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿40粒種子避光，蒸餾水培養(yǎng).待幼苗長(zhǎng)至一葉一心時(shí)，分別用1.2.1中的處理液進(jìn)行處理，每個(gè)處理重復(fù)2次.

1.3 測(cè)定

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

培養(yǎng)5 d后，每個(gè)處理組隨機(jī)選取10株幼苗，測(cè)量根長(zhǎng)和株高.

1.3.2 生理指標(biāo)

用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液提取葉綠素，采用紫外分光光度法[9]測(cè)定含量；采用考馬斯亮藍(lán)法[10]測(cè)定可溶性蛋白含量；采用蒽酮法[11]測(cè)定可溶性糖含量；采用酸性茚三酮法[12]測(cè)定游離脯氨酸含量；采用硫代巴比妥酸法[13]測(cè)定丙二醛含量.測(cè)定時(shí)每種處理均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Excel2003軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 HM618對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗生長(zhǎng)的影響

用12種處理液培養(yǎng)小麥幼苗5 d后，測(cè)量其生長(zhǎng)指標(biāo)，結(jié)果如表1所示.由表1可以看出，隨著CdCl2處理濃度的增加，小麥幼苗的根長(zhǎng)和株高均顯著降低，即CdCl2脅迫抑制了小麥幼苗的生長(zhǎng).在沒有鎘脅迫的情況下（A1～A4），HM618發(fā)酵液能夠顯著促進(jìn)株高（P＜0.05），對(duì)根長(zhǎng)沒有促進(jìn)作用.在20mg/L CdCl2脅迫下，同不用發(fā)酵液處理相比，用10、20、40mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗，根長(zhǎng)分別增加了1.12%、8.50%和15.46%，株高分別增加了1.93%、24.18%和18.86%.在80 mg/L CdCl2脅迫下，與不用發(fā)酵液處理相比，用10、20、40 mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗，根長(zhǎng)分別增加了24.57%、39.31%和43.24%，株高分別增加了14.86%、20.42%和28.19%.由此可見，鎘脅迫越嚴(yán)重，解淀粉芽孢桿菌HM618發(fā)酵液對(duì)小麥幼苗受毒害的緩解效果越明顯，尤其是對(duì)于根部生長(zhǎng)的促進(jìn)作用效果顯著.

表1 不同處理組中小麥幼苗的根長(zhǎng)和株高Tab.1 Root length and plant height of wheat seedlings in different groups cm

2.2 HM618對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗葉綠素含量的影響

葉綠素含量能夠直接反映出植物光合作用強(qiáng)度.測(cè)量不同處理組中小麥幼苗的葉綠素含量，結(jié)果如圖1所示.

圖1 不同處理組中小麥幼苗的葉綠素含量Fig.1 Content of chlorophyll in wheat seedlings in different groups

由圖1可以看出，隨著CdCl2脅迫濃度的增加，小麥幼苗葉綠素含量逐漸降低（P＜0.05），即CdCl2脅迫會(huì)抑制葉綠素合成.在沒有鎘脅迫的情況下，對(duì)小麥幼苗單獨(dú)施加解淀粉芽孢桿菌時(shí)，葉綠素含量有輕微增加（P＞0.05）.在20 mg/L CdCl2脅迫下，與不用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵液處理相比，用10、20、40 mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗，葉綠素含量分別增加了8.04%、16.30%和 22.47%（P＜0.05）.在80 mg/L CdCl2脅迫下，與不用發(fā)酵液處理相比，用10、20、40 mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗，葉綠素含量分別增加了10.05%、16.33%和30.03%.由此可見，解淀粉芽孢桿菌對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗葉綠素含量的降低有緩解作用，且發(fā)酵液越多效果越好.

2.3 HM618對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗可溶性蛋白含量的影響

可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).測(cè)量不同處理組中小麥幼苗的可溶性蛋白含量，結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同處理組中小麥幼苗的可溶性蛋白含量Fig.2 Content of soluble protein in wheat seedlings in different groups

由圖2可以看出，隨著CdCl2脅迫濃度的增加，小麥幼苗葉片可溶性蛋白含量逐漸降低（P＜0.05）.在沒有鎘脅迫的情況下，用HM618發(fā)酵液處理小麥幼苗時(shí)，葉片可溶性蛋白的含量會(huì)顯著降低（P＜0.05）.與不用發(fā)酵液處理相比，用10、20、40 mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗時(shí)，20 mg/L CdCl2脅迫組中葉片可溶性蛋白含量分別增加了13.15%、16.59%和40.17%（P＜0.05）；80 mg/L CdCl2脅迫組中葉片可溶性蛋白含量分別增加了7.48%、15.62%和17.81%.由此可見，解淀粉芽孢桿菌對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗葉片可溶性蛋白含量的減少有緩解作用.

2.4 HM618對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗可溶性糖含量的影響

可溶性糖能夠?yàn)橹参锷L(zhǎng)發(fā)育提供能量和代謝中間產(chǎn)物，同時(shí)具有信號(hào)功能參與代謝調(diào)控.測(cè)量不同處理組中小麥幼苗的可溶性糖含量，結(jié)果如圖3所示.

圖3 不同處理組中小麥幼苗的可溶性糖含量Fig.3 Content of soluble sugar in wheat seedlings in different groups

由圖3可以看出，隨著CdCl2脅迫濃度的增加，小麥幼苗葉片可溶性糖含量逐漸增加，這可能是因?yàn)殒k脅迫刺激下植物啟動(dòng)了自身的保護(hù)系統(tǒng).鎘脅迫處理下，施加10 mL的HM618發(fā)酵液使小麥幼苗的可溶性糖含量略有降低（P＞0.05）.發(fā)酵液施加量為20 mL和40 mL時(shí)，可溶性糖含量顯著降低（P＜0.05），2種施加量的效果相近，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）.由此可見，解淀粉芽孢桿菌對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗葉片可溶性糖含量的增加有緩解作用.

2.5 HM618對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗脯氨酸含量的影響

脯氨酸是植物體內(nèi)重要和有效的有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在一定程度上反映了植物體內(nèi)的水分狀況和抗逆性.測(cè)量不同處理組中小麥幼苗的脯氨酸糖含量，結(jié)果如圖4所示.

圖4 不同處理組中小麥幼苗的脯氨酸含量Fig.4 Content of proline in wheat seedlings in different groups

由圖4可以看出，隨著CdCl2脅迫程度的增加，小麥幼苗葉片中的脯氨酸含量逐漸增加，即CdCl2激發(fā)了小麥幼苗的抗逆機(jī)能.用HM618發(fā)酵液處理后，小麥幼苗葉片中的脯氨酸含量顯著降低，尤其是用20 mL和40 mL的發(fā)酵液處理，脯氨酸含量顯著降低.由此認(rèn)為，解淀粉芽孢桿菌對(duì)鎘脅迫下小麥脯氨酸含量的增加有緩解作用.

2.6HM618對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，因此可通過測(cè)定MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接判斷膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性.測(cè)量不同處理組中小麥幼苗的MDA含量，結(jié)果如圖5所示.

由圖5可以看出，隨著CdCl2脅迫濃度的增加，小麥幼苗葉片MDA含量逐漸增加，并且各處理組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.由此可見CdCl2脅迫會(huì)促進(jìn)小麥幼苗葉片MDA的積累.無鎘脅迫時(shí)，HM618發(fā)酵液對(duì)小麥幼苗葉片MDA含量作用不明顯.與不用發(fā)酵液處理相比，用10、20、40mL的發(fā)酵液處理小麥幼苗時(shí)，20 mg/L CdCl2脅迫處理組中，葉片MDA含量分別降低了3.39%，8.81%和12.10%（P＜0.05）；在80 mg/L CdCl2脅迫處理組中，葉片MDA含量分別降低了6.46%、11.96%和15.69%.由此可見，解淀粉芽孢桿菌對(duì)鎘脅迫下小麥幼苗葉片MDA含量的增加有緩解作用，且施加量越大效果越好.

圖5 不同處理組中小麥幼苗的MDA含量Fig.5 Content of MDA in wheet seedlings in different groups

3 討論與結(jié)論

本課題組研究了解淀粉芽孢桿菌HM618對(duì)小麥幼苗鎘脅迫的緩解作用.小麥幼苗在遭受到鎘脅迫時(shí)，根長(zhǎng)和株高均顯著降低，葉片內(nèi)的葉綠素和可溶性蛋白含量降低，可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量增加.葉綠素含量是植物光合作用的重要指標(biāo)[14]，鎘脅迫會(huì)干擾植物體內(nèi)Fe的代謝以及對(duì)Mn、Zn、Mg等礦質(zhì)元素的吸收，從而使葉綠素含量下降.可溶性蛋白可作為酶參與植物體內(nèi)各種代謝，是植物在逆境中重要的生理指標(biāo).鎘脅迫程度較小時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)合成一些蛋白質(zhì)來提高抗性；鎘脅迫程度較大時(shí)，植物體內(nèi)的防御體系會(huì)受到損傷，蛋白質(zhì)合成受到抑制[15].可溶性糖不僅是植物的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì).植物遭受逆境脅迫時(shí)，植物體內(nèi)可溶性糖含量增加，對(duì)細(xì)胞膜、原生質(zhì)體和酶類有一定的保護(hù)作用[16].幾乎所有逆境都會(huì)造成植物體內(nèi)脯氨酸的積累，脯氨酸在抗逆中有2個(gè)作用：一方面，作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)防止水分散失；另一方面，保護(hù)膜結(jié)構(gòu)的完整性.鎘脅迫會(huì)影響植物體內(nèi)多種酶的活性，使金屬硫蛋白和植物螯合肽的合成增加，從而促進(jìn)脅迫蛋白和游離氨基酸的積累[17].植物在逆境受到損傷后，體內(nèi)會(huì)積累過多的活性氧，產(chǎn)生膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛[18-19].鎘脅迫使植物體內(nèi)產(chǎn)生自由基，發(fā)生膜脂過氧化作用，從而使MDA含量顯著增加[20].

對(duì)鎘脅迫下的小麥幼苗施加解淀粉芽孢桿菌HM618發(fā)酵液后，葉片中葉綠素含量和可溶性蛋白含量顯著增加，可溶性糖、脯氨酸和MDA含量下降.陳淋[8]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌能夠提高鹽脅迫下玉米和擬南芥的葉綠素含量，從而提高光合作用能力，這一點(diǎn)與本研究結(jié)果相同.本研究中解淀粉芽孢桿菌會(huì)降低鎘脅迫下小麥幼苗的脯氨酸和可溶性糖含量，這可能是由于小麥幼苗遭受輕度鎘脅迫時(shí)能夠調(diào)動(dòng)自身抗性，增加脯氨酸和可溶性糖的合成，以抵御鎘脅迫的影響.當(dāng)施加解淀粉芽孢桿菌時(shí)，小麥幼苗的鎘脅迫得到緩解，使得脯氨酸和可溶性糖的合成降低，具體機(jī)制需要進(jìn)一步探討.