miRNA-204靶向Bcl-2誘導(dǎo)胰島 β細(xì)胞凋亡

陶 蕾，尚慶文

（南京中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，江蘇南京 210000）

糖尿病是一種復(fù)雜的糖脂代謝紊亂性疾病，與環(huán)境和遺傳密切相關(guān)，而進行性的胰島β細(xì)胞損傷是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。長期暴露于高糖高脂條件下，會導(dǎo)致大量胰島β細(xì)胞凋亡，進而加重胰島素分泌不足。研究調(diào)控胰島β細(xì)胞凋亡的相關(guān)機制對于糖尿病的治療具有重要意義。微RNA（microRNA，miRNA，miR）是一類長20～24個核苷酸的小分子單鏈RNA，由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，廣泛參與調(diào)控其他基因表達(dá)。隨著對miRNA的研究深入，發(fā)現(xiàn)miRNA不僅可以作為疾病診療的生物標(biāo)記物，也可直接參與某些病理信號通路的調(diào)節(jié)［2］。miR-204是一類胰島β細(xì)胞高度富集的miRNA，與胰島β細(xì)胞功能密切相關(guān)［3］。已有研究表明，在肝癌和食管癌組織中miR-204可以促進腫瘤細(xì)胞凋亡，且肥胖狀態(tài)下胰島組織miR-204含量會顯著升高。而胰島β細(xì)胞特異性高表達(dá)的miR-204是否參與調(diào)控胰島β細(xì)胞凋亡及其作用機制有待進一步闡明［4-6］。本研究通過在小鼠胰島瘤細(xì)胞MIN6上過表達(dá)miR-204，并且聯(lián)合應(yīng)用miR-204下游靶點Bcl-2過表達(dá)質(zhì)粒，探討miR-204/Bcl-2在胰島β細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

miR-204化學(xué)合成過表達(dá)物和Bcl-2過表達(dá)質(zhì)?！睟cl-2（+）〕由中國吉瑪公司構(gòu)建和合成；Lipo?fectamine 2000和Trizol購自于美國Invitrogen公司；Opti-MEM、DMEM高糖和低糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；β-巰基乙醇和噻唑藍(lán)（MTT）購自中國Sigma公司；小鼠Bcl-2（sc-7382）單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，兔Bax（ab32503）單克隆抗體、活化的兔胱天蛋白酶3（ab49822）多克隆抗體和小鼠GAPDH（ab8245）單克隆抗體購自英國Abcam公司；山羊抗兔IgG（H+L）和山羊抗小鼠IgG（H+L）抗體購自中國Protein?tech公司；Hoechst33258染料購自于中國碧云天公司；BCA蛋白定量分析試劑盒和ECL顯影試劑盒購自美國Thermo SCIENTIFIC公司；其他生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。所用引物由中國上海生工技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠胰島β瘤細(xì)胞MIN6購自美國ATCC，細(xì)胞采用含β-巰基乙醇（10 μL·L-1）的DMEM高糖培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。至MIN6細(xì)胞長至80%開始鋪板實驗。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

MIN6細(xì)胞分別以每孔5×103，2×104或1×105密度分別接種于96孔板、24孔板或6孔板，培養(yǎng)過夜完全貼壁后，根據(jù)實驗分組，按照Lipofectamine 2000說明書推薦濃度，miR-204（+）組轉(zhuǎn)染miR-204化學(xué)合成過表達(dá)物5 pmol·L-1，miR204（+）+Bcl-2（+）組轉(zhuǎn)染miR-204化學(xué)過表達(dá)物5 pmol·L-1和每孔0.2 μg（96孔板）、每孔0.8 μg（24孔板）或2 μg（6孔板）的Bcl-2過表達(dá)質(zhì)粒，正常對照組轉(zhuǎn)染等量Lipo?fectamine 2000，Bcl-2（+）組轉(zhuǎn)染每孔0.2 μg（96孔板）、0.8 μg（24孔板）或2 μg（6孔板）的Bcl-2過表達(dá)質(zhì)粒，并于無血清Opti-MEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染5 h后更換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，進行后續(xù)實驗處理。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞存活

MIN6細(xì)胞以每孔5×103的密度接種至96孔板，培養(yǎng)過夜完全貼壁后，根據(jù)實驗?zāi)康倪M行以下分組：正常對照組、miR-204（+）組、miR-204（+）+Bcl-2（+）組，于無血清Opti-MEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染5 h后更換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL MTT（5.0 g·L-1），置細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，板底甲瓚由每孔200 μL DMSO復(fù)溶，562 nm檢測各組吸光度（A562nm）。細(xì)胞存活率（%）=處理組A562nm/正常對照組A562nm×100%。

1.5 ELISA法測定細(xì)胞上清液胰島素含量

MIN6細(xì)胞以5×103的密度接種至96孔板，培養(yǎng)過夜完全貼壁后，分為正常對照組、miR-204（+）組、miR-204（+）+Bcl-2（+）組，于無血清Opti-MEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染，5 h后更換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸棄上清液，37℃的PBS清洗1次，使用PBS繼續(xù)孵育30 min，吸棄上清液。MIN6細(xì)胞繼續(xù)分別在含葡萄糖濃度為3和30 mmol·L-1的克林緩沖液（mmo·L-1：NaCl 130，KCl 5，MgSO41.27，CaCl20.95，NaH2PO4/Na2HPO410，pH 7.4）孵育30 min。分別收集上清液和細(xì)胞蛋白，并按胰島素ELISA說明書檢測上清胰島素含量。

1.6 Hoechst33258染色觀察細(xì)胞凋亡

MIN6細(xì)胞以每孔2×104的密度接種至24孔板，培養(yǎng)過夜完全貼壁后，分為正常對照組、miR-204（+）組、miR-204（+）+Bcl-2（+）組，于無血清Opti-MEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染，5 h后更換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，37℃的PBS清洗3次×5 min，每孔加入200 μL 4%多聚甲醛于37℃固定10 min，吸棄固定液，PBS清洗3 次×5 min后，按每孔200 μL加入Hoechst33258染料染色10 min，PBS清洗3次×5 min后，熒光顯微鏡下拍照。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）檢測miR-204、Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶3 mRNA水平

24孔板內(nèi)細(xì)胞按正常對照組、miR-204（+）組、miR-204（+）+Bcl-2（+）組分組轉(zhuǎn)染處理48 h后，采用Trizol法進行細(xì)胞內(nèi)總RNA提取。逆轉(zhuǎn)錄過程采用Transgen公司的第一鏈cDNA合成試劑盒按照說明操作進行逆轉(zhuǎn)錄，條件為42℃30 min、85℃5 min。qPCR采用羅氏公司的Fast Start Universal SYBR Green于ABI7300進行產(chǎn)物擴增，擴增采用兩步法，第一步：95℃10 min，第二步循環(huán)40次：95℃ 15 s、60℃ 1 min。miRNA采用U6作為內(nèi)參，mRNA采用GAPDH作為內(nèi)參。qPCR特異引物序列為：miR-204：5′-GCCCGTTCCCTTTGT?CATC-3′，5′-TCCAGTGCAGGGTCCGAG-3′；U6：5′-GATGACACGCAAATTCGTGAA-3′，5′-GATGACACGCAAATTCGTGAA-3′；Bcl-2：5′-GAGAGCGTCAACAGGGAGATG-3′，5′-CCAGCCTCCGTTATCCTGGA-3′；Bax：5′-TGG AGCT?GCAGAGGATGATTG-3′，5′-GAAGTTGCCGTCAGAAAACATG-3′；胱天蛋白酶 3：5′-TGGAACAAATGGACCTGTTGACC-3′，5′-GGACTCAAATTCT?GTTGCCACC-3′；GAPDH：5′-AGGTCGGTGT?GAACGGATTTG-3′，5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。用2-ΔΔCt表示mRNA的相對表達(dá)水平。

1.8 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測Bcl-2、BAX和活化的胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)

6孔板內(nèi)細(xì)胞按正常對照組、miR-204（+）組、miR-204（+）+Bcl-2（+）組分組轉(zhuǎn)染處理48 h后，采用每孔加入150 μL RIPA裂解液提取總蛋白。BCA法定量蛋白后，采用30 μg蛋白上樣量于12%或15%分離膠下進行電泳，電泳結(jié)束后采用濕法轉(zhuǎn)膜2 h，PVDF膜于室溫條件下用5%脫脂牛奶封閉2 h，室溫條件下加入一抗〔Bcl-2抗體（1∶1000）、Bax抗體（1∶1000）、活化的胱天蛋白酶3抗體（1∶500）、GAPDH抗體（1∶2000）〕孵育2 h，二抗（1∶5000）孵育1.5 h，孵育結(jié)束后于ECL化學(xué)發(fā)光顯影儀下顯影，采用Quantity One軟件進行積分吸光度值統(tǒng)計，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白的積分吸光度值比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)均采用x±s表示，用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件采用t檢驗進行分析。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)miR-204和（或）Bcl-2對MIN6細(xì)胞存活率的影響

MTT結(jié)果顯示，miR-204（+）組細(xì)胞存活率為（73.7±3.3）%，顯著低于正常對照組（100.0±2.2）%（P＜0.01）；miR-204（+）+Bcl-2（+）組細(xì)胞存活率為（83.5±1.9）%，顯著高于miR-204（+）組（P＜0.05）。

2.2 過表達(dá)miR-204和（或）Bcl-2對MIN6細(xì)胞凋亡的影響

Hoechst33258染色結(jié)果如圖1所示，正常對照組細(xì)胞核呈正常藍(lán)色，miR-204（+）組大量細(xì)胞核呈致密濃染（如箭頭所示），miR-204（+）+Bcl-2（+）組凋亡細(xì)胞核數(shù)目相較于miR-204（+）組有所減少（如箭頭所示）。

Fig.1 Effect of overexpression of miRNA-204〔miR-204（+）〕and/or with Bal-2〔Bcl-2（+）〕on MIN6 cell apoptosis by Hoechst33258.Arrows show apoptotic cells.

2.3 過表達(dá)miR-204和（或）Bcl-2對MIN6細(xì)胞胰島素分泌的影響

ELISA結(jié)果（表1）顯示，與正常對照組相比，葡萄糖30 mmol·L-1刺激下，miR-204（+）組胰島素分泌量顯著降低（P＜0.01），miR-204（+）+Bcl-2（+）組胰島素分泌量則顯著高于miR-204（+）組（P＜0.01）。

Tab.1 Effect of overexpression of miR-204 and/or with Bcl-2 on MIN6 cell insulin secretion

2.4 過表達(dá)miR-204和（或）Bcl-2對MIN6細(xì)胞miR-204水平和Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶3 mRNA水平的影響

qPCR結(jié)果顯示（圖2），與正常對照組相比，miR-204在miR-204（+）和miR-204（+）+Bcl-2（+）組含量均顯著升高（P＜0.01），而miR-204（+）組的Bcl-2 mRNA水平則顯著降低（P＜0.01），并低于miR-204（+）+Bcl-2（+）組（P＜0.01），各組 Bax和胱天蛋白酶3 mRNA含量無顯著差別。

2.5 過表達(dá)miR-204和（或）Bcl-2對MIN6細(xì)胞Bcl-2、Bax和活化的胱天蛋白酶3蛋白表達(dá)水平的影響

Western蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示（圖3），與正常對照組相比，miR-204（+）組Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.01）；miR-204（+）+Bcl-2（+）組Bcl-2蛋白水平高于miR-204（+）組（P＜0.05）。與正常對照組相比，miR-204（+）組Bax蛋白水平顯著升高（P＜0.01）；miR-204（+）+Bcl-2（+）組Bax蛋白水平顯著低于miR-204（+）組（P＜0.01）。與正常對照組相比，miR-204（+）組Bcl-2/Bax比值顯著降低（P＜0.01）；miR-204（+）+Bcl-2（+）組Bcl-2/Bax比值高于miR-204（+）組（P＜0.01）。與正常對照組相比，miR-204（+）組活化的胱天蛋白酶3蛋白水平顯著降低（P＜0.01）；miR-204（+）+Bcl-2（+）組活化的胱天蛋白酶3蛋白水平顯著高于miR-204（+）組（P＜0.01）。

Fig.2 Effect of overexpression of miR-204 and/or with Bcl-2 on mRNA expressions of miR-204（A），Bcl-2（B），Bax（C）and caspase 3（D）by qPCR.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with miR-204（+）group.

Fig.3 Effect of overexpression miR-204 and/or with Bcl-2 on protein expressions of Bcl-2（B），Bax（C），Bcl-2/Bax（D）and cleaved caspase 3（E）by Western blotting.B，C，D and E were the semi-quantitative results of A.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with miR-204（+）group.

3 討論

本研究利用小鼠MIN6細(xì)胞過表達(dá)miR-204和Bcl-2，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-204能夠通過抑制Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)，進而激活線粒體凋亡Bax/胱天蛋白酶3信號通路，促進MIN6細(xì)胞凋亡，降低葡萄糖刺激下的MIN6細(xì)胞胰島素分泌。本研究表明，miR-204誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的凋亡機制可能是通過抑制Bcl-2導(dǎo)致Bcl-2/Bax異源二聚體失衡，進而導(dǎo)致胰島β細(xì)胞大量凋亡。

Shu等［7］的研究表明，前列腺癌細(xì)胞系和前列腺癌患者腫瘤區(qū)域miR-204表達(dá)降低；給予過表達(dá)miR-204后，前列腺癌細(xì)胞線粒體凋亡通路被激活，其潛在機制可能是通過靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1/P53通路。Wang等［8］的研究表明，過表達(dá)miR-204能夠通過靶向信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3通路抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進乳腺癌細(xì)胞凋亡。Xu等［9］的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-204能夠通過抑制蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡。以上實驗與本研究結(jié)果一致，均證明了miR-204促進細(xì)胞凋亡。Marzinotto等［10］的研究進一步表明，miR-204的含量與胰島細(xì)胞分型有關(guān)，高表達(dá)于胰島β細(xì)胞。盡管miR-204與Bcl-2的關(guān)系在胰島β細(xì)胞凋亡中尚不明確，在其他細(xì)胞系和組織上已驗證Bcl-2是miR-204的直接下游調(diào)控靶點[11-13]。Sacconi等［11］檢測胃癌組織和癌旁組織發(fā)現(xiàn)，miR-204能夠通過抑制Bcl-2促進癌細(xì)胞凋亡。Wang等［12］在神經(jīng)元細(xì)胞上證明了缺氧誘導(dǎo)miR-204高表達(dá)，進而靶向Bcl-2促進神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。Kuwano等［13］進一步利用熒光報告素酶實驗證明了miR-204和Bcl-2的靶向調(diào)控關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞過表達(dá)miR-204可通過抑制Bcl-2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞miR-204特異性高表達(dá)可能是糖尿病狀態(tài)下影響胰島素分泌的重要危險因素，調(diào)控胰島組織miR-204/Bcl-2信號通路有助于保護β細(xì)胞，改善糖尿病狀態(tài)下的胰島素分泌及胰島素抵抗。