外源NO供體對(duì)水分虧缺下玉米葉片碳同化關(guān)鍵酶及抗氧化系統(tǒng)的影響

楊青華 鄭博元 李蕾蕾 賈雙杰 韓心培 郭家萌 王泳超 邵瑞鑫

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外源NO供體對(duì)水分虧缺下玉米葉片碳同化關(guān)鍵酶及抗氧化系統(tǒng)的影響

楊青華 鄭博元 李蕾蕾 賈雙杰 韓心培 郭家萌 王泳超 邵瑞鑫*

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 河南鄭州 450046

為了探討外源NO供體(硝普鈉, SNP)對(duì)水分虧缺下玉米葉片碳同化關(guān)鍵酶及抗氧化系統(tǒng)的影響及其調(diào)控機(jī)制, 在20% PEG-6000模擬水分虧缺脅迫下, 研究了SNP對(duì)玉米品種駐玉309幼苗葉片光合碳同化核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)和Rubisco活化酶(RCA)活性及其基因表達(dá)、抗氧化酶活性及其同工酶譜變化的影響。結(jié)果表明, 在水分虧缺脅迫下, SNP顯著上調(diào)玉米葉片L、S、β基因的相對(duì)表達(dá)量, 尤其是葉片S基因的相對(duì)表達(dá)量增加1.86倍, 葉片Rubisco、RCA活性分別提高32.7%和14.67%; 葉片超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性及其同工酶譜帶的寬度和亮度顯著增強(qiáng), 而ROS積累量明顯降低。說(shuō)明在PEG水分虧缺脅迫下, SNP能顯著提升玉米幼苗葉片光合碳同化能力及抗氧化酶活性, 降低ROS積累及其對(duì)細(xì)胞膜造成的損傷, 提高玉米的抗干旱性。

外源一氧化氮; 水分虧缺; 玉米幼苗; 光合碳同化; 抗氧化系統(tǒng)同工酶

水資源短缺是制約全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的一個(gè)嚴(yán)峻生態(tài)問題[1], 目前我國(guó)水資源已成為限制糧食持續(xù)增產(chǎn)的主要瓶頸。玉米作為我國(guó)第一大糧食作物, 在國(guó)家糧食安全中起著重要作用。近年來(lái), 由于氣候的變化, 我國(guó)約有60%的玉米面積受到干旱影響, 每年因旱災(zāi)減產(chǎn)15%~20%, 干旱災(zāi)害已成為制約玉米持續(xù)增產(chǎn)的關(guān)鍵生態(tài)因素[2]。因此, 提高玉米的抗旱性, 對(duì)實(shí)現(xiàn)玉米可持續(xù)生產(chǎn)及保障國(guó)家糧食安全具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

光合作用作為植物生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵的代謝過(guò)程, 對(duì)干旱脅迫反應(yīng)非常敏感[3-4]。在水分虧缺下, 光合作用的下調(diào)與葉綠體內(nèi)的核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)、Rubisco活化酶(RCA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸磷酸激酶、NADP-蘋果酸脫氫酶等光合酶活性的變化有關(guān)[5]。其中, Rubisco和RCA是在光合作用中固定CO2的關(guān)鍵酶, 研究表明耐旱型植株在干旱脅迫后Rubisco和RCA具有相對(duì)較高的酶活性和轉(zhuǎn)錄水平[6-7]。光合碳同化對(duì)干旱脅迫的適應(yīng)性主要通過(guò)調(diào)節(jié)其基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn), 已表明Rubisco大亞基L由葉綠體基因編碼, 小亞基S由核基因編碼, 二者在受到干旱脅迫時(shí)的表達(dá)量明顯影響著植物對(duì)脅迫的適應(yīng)性[3]。此外, 植物抵御不利環(huán)境的能力還與其細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗氧化能力密切相關(guān), 因?yàn)樯矬w處于逆境下時(shí), 體內(nèi)的抗氧化酶同工酶表達(dá)會(huì)發(fā)生顯著的變化, 若維持較高的超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性及類胡蘿卜素(Car)、抗壞血酸(AsA)含量, 以降低膜質(zhì)過(guò)氧化程度, 可提高植物的抗逆性[8]。

一氧化氮(NO)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育, 是逆境脅迫下植物防御響應(yīng)的信號(hào)分子, 被確認(rèn)為是一種新的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)[9-10]。近年來(lái), 較多研究報(bào)道了外源NO供體(硝普鈉, SNP)提高植物的抗旱性。SNP可誘導(dǎo)小麥D1蛋白快速周轉(zhuǎn)以激活失去活性的PSII反應(yīng)中心, 維持較高的PSII最大光化學(xué)效率, 保護(hù)葉綠體結(jié)構(gòu)不受干旱脅迫下ROS積累的破壞[11-12]; 能促進(jìn)紅蕓豆葉片SOD、CAT、POD同工酶的表達(dá), 提高干旱脅迫下小麥、水稻葉片保護(hù)酶的活性, 從而增強(qiáng)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[13-15]。但這些研究主要集中在小麥、水稻、擬南芥等作物, 而關(guān)于SNP對(duì)水分虧缺下玉米葉片碳同化關(guān)鍵酶及抗氧化系統(tǒng)的影響及其調(diào)控機(jī)制研究還未見報(bào)道。本文在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上, 深入探討了SNP在PEG模擬水分虧缺脅迫下對(duì)玉米葉片碳同化相關(guān)酶Rubisco、RCA及其基因表達(dá)和抗氧化酶系統(tǒng)活性及其同工酶譜的影響, 旨在明確SNP的調(diào)控機(jī)制, 并為生產(chǎn)上利用SNP提高玉米抗旱性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

精選水分敏感玉米品種駐玉309[16]的種子, 用1.8% (v/v)次氯酸鈉表面消毒5 min, 蒸餾水反復(fù)沖洗后, 浸種10 h, 在25°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)暗催芽4 d, 轉(zhuǎn)入1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)至三葉一心, 改用全營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng), 同時(shí)用100 μmol L–1的SNP預(yù)處理3 d (四葉一心), 20% PEG-6000 (-0.8 MPa)模擬中度水分虧缺脅迫處理3 d, 處理期間每天更換營(yíng)養(yǎng)液。幼苗生長(zhǎng)的晝/夜溫度為(27 ± 1) °C /(22 ± 1) °C, 光強(qiáng)為250 μmol m–2s–1, 濕度為(60 ± 5)%。在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)4個(gè)處理, 即CK (0% PEG, 對(duì)照)、SNP (100 μmol L–1SNP)、PEG (20% PEG)、SNP + PEG (100 μmol L–1SNP + 20% PEG), 每個(gè)處理重復(fù)3次, 每盆定苗12株[盆大小為21 cm ×16 cm × 13 cm (長(zhǎng)×寬×高)]。在脅迫后第3天選取完全展開的倒二葉于液氮中保存, 選取葉片中部, 除去葉脈, 進(jìn)行生理生化指標(biāo)和Real time PCR檢測(cè)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.1 活性氧含量、抗氧化系統(tǒng)、Rubisco和RCA活性的測(cè)定 根據(jù)李忠光和龔明方法測(cè)定O2–產(chǎn)生速率[17]。采用硫酸鈦比色法測(cè)定H2O2含量[18]。參照鄒琦[19]的方法略加改進(jìn)測(cè)定SOD、POD、CAT的活性。

采用植物酶聯(lián)免疫分析試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))測(cè)定Rubisco、RCA活性。取葉片中部0.1 g, 置研缽中加液氮及1%不溶性PVP研磨, 加入1.9 mL預(yù)冷提取液(50 mmol L–1HEPES- KOH pH 7.0, 1 mmol L–1EDTA, 5 mmol L–1MgCl2, 0.4 mmol L–1ATP, 15 mmol L–1DTT, 1 mmol L–1PMSF, 2 mmol L–1Benzamidine, 0.01 mmol L–1Leupeptin), 磨成均漿, 15 000′離心10 min, 上清液用于測(cè)定酶活性。

1.2.2 Rubisco和RCA基因的Real-time PCR分析

根據(jù)GenBank已上傳編碼D1蛋白的編碼Rubisco的小亞基蛋白S基因序列、編碼Rubisco大亞基蛋白L基因序列、編碼RCA蛋白的β基因序列同源性設(shè)計(jì)Real-time PCR的引物, 選其內(nèi)參基因?yàn)閍ctin, 利用DNAMAN和Premier 5.0軟件依據(jù)GenBank 已上傳的序列(GI: 1498383; GI: 1498383)的同源性設(shè)計(jì)引物序列(表1)。

在20 μL反應(yīng)體系中包含10 μL SYBR Green QPK-201、0.8 μL正義及反義端的引物、1 μL cDNA模板以及7.4 μL ddH2O。PCR條件為95°C預(yù)變性3 min; 95°C變性7 s, 57°C退火10 s, 72°C延伸10 s, 40個(gè)循環(huán); 72°C延伸10 min, 65~95°C溶解曲線。

表1 本實(shí)驗(yàn)引物序列

以actin基因作為內(nèi)參, 采用相對(duì)定量方法, 通過(guò)比較CT值法(2–ΔΔCT法)進(jìn)行熒光定量數(shù)據(jù)分析。

改變的倍數(shù)＝2–ΔΔCT, ΔΔCT＝(CT靶基因-CT內(nèi)參)處理組-(CT靶基因-CT內(nèi)參)未處理組。

1.2.3 抗氧化酶同工酶的測(cè)定 準(zhǔn)確稱取1 g葉片, 加入少量提樣緩沖液, 置冰浴研磨勻漿后定容至5 mL, 10 000×離心15 min, 上清液為可溶性蛋白的粗提液, 用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量, 粗提液貯于冰箱備用。參照李文鶴[20]的方法對(duì)SOD、POD、CAT的同工酶染色測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 并用SigmaPlot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NO對(duì)干旱脅迫下玉米葉片Rubisco活性以及RCA活性的影響

干旱條件下, 玉米葉片Rubisco及RCA活性與CK相比分別降低了42.3%和33.3% (圖1)。SNP + PEG處理的幼苗, 其葉片Rubisco及RCA的活性分別較PEG脅迫處理上升32.70%和14.67%, 而單獨(dú)的SNP處理之后, 其玉米幼苗葉片的RCA活性與CK無(wú)顯著差異, 葉片Rubisco活性則較CK有所降低。

圖1 外源NO對(duì)干旱脅迫下玉米幼苗Rubisco活性(A)及活化酶RCA活性(B)的影響

處理CK、SNP、PEG、SNP + PEG分別為0% PEG、100 μmol L–1SNP、20% PEG和100 μmol L–1SNP + 20% PEG。

Treatments including CK, SNP, PEG, and SNP + PEG indicate 0% PEG, 100 μmol L–1SNP, 20% PEG, and 100 μmol L–1SNP + 20% PEG, respectively.

2.2 NO對(duì)干旱脅迫下玉米葉片rbc L、rbc S、rca β基因表達(dá)水平的影響

干旱脅迫后, 玉米葉片L基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平下降, 而S基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平略有上升(圖2),β基因的相對(duì)表達(dá)量較CK降低了77.1%; SNP + PEG處理的幼苗, 其葉片L、S和β基因的轉(zhuǎn)錄水平較PEG處理分別提高73.4%、78.1%和109.1%; 單獨(dú)SNP處理之后的幼苗, 其葉片LS和β基因的相對(duì)表達(dá)量與CK無(wú)顯著差異。

2.3 NO對(duì)干旱脅迫下玉米葉片ROS積累的影響

干旱條件下, 玉米幼苗葉片的O2-和H2O2含量均顯著升高(圖3), 與CK相比分別上升284.3%和21.0%。SNP + PEG處理的幼苗, 其葉片O2-、H2O2含量比干旱處理分別降低了27.4%和17.9%, 而單獨(dú)的SNP處理之后, 其葉片O2-、H2O2含量與CK無(wú)顯著差異。這表明NO預(yù)處理可明顯改善干旱脅迫條件下玉米幼苗葉片活性氧的積累。

2.4 NO對(duì)干旱脅迫下玉米葉片抗氧化酶活性及其同工酶的影響

干旱脅迫和單獨(dú)SNP處理與CK相比, 玉米幼苗葉片SOD活性分別提高66.5%和108.1%。SNP預(yù)處理之后進(jìn)行干旱脅迫, 其活性進(jìn)一步增加, 較PEG處理提升37.7% (圖4-A)。SNP 處理和PEG脅迫后SOD同工酶譜帶(圖4-B)的寬度和亮度都高于CK, 尤其是SNP處理。

圖2 外源NO對(duì)干旱脅迫下玉米rbc S (A)、rbc L (B)和rca β (C)的影響

處理CK、SNP、PEG、SNP + PEG分別為0% PEG、100 μmol L–1SNP、20% PEG和100 μmol L–1SNP + 20% PEG。

Treatments including CK, SNP, PEG, and SNP + PEG indicate 0% PEG, 100 μmol L–1SNP, 20% PEG, and 100 μmol L–1SNP + 20% PEG, respectively.

圖3 外源NO處理對(duì)干旱脅迫下玉米幼苗O2-(A)和H2O2(B)含量的影響

處理CK、SNP、PEG、SNP + PEG分別為0% PEG、100 μmol L–1SNP、20% PEG和100 μmol L–1SNP + 20% PEG。

Treatments including CK, SNP, PEG, and SNP + PEG indicate 0% PEG, 100 μmol L–1SNP, 20% PEG, and 100 μmol L–1SNP + 20% PEG, respectively.

玉米幼苗葉片的POD和CAT活性在PEG脅迫后分別較CK降低33.3%和56.0% (圖5-A, 6-A)。單獨(dú)SNP處理之后, 其葉片的POD活性較CK提高10.8%, 而葉片CAT酶活性與CK差異不顯著。SNP + PEG處理的幼苗, 其葉片的POD、CAT活性與PEG處理相比分別提高25.0%和67.9%。圖5-B和圖6-B結(jié)果顯示, PEG脅迫處理葉片的POD、CAT同工酶譜帶在寬度和亮度上弱于CK, 單獨(dú)SNP預(yù)處理之后, 增強(qiáng)不顯著, 而SNP + PEG處理的幼苗葉片POD、CAT同工酶譜帶, 較PEG脅迫處理的寬度和亮度明顯增強(qiáng)。

圖4 外源NO處理對(duì)干旱脅迫下玉米幼苗SOD活性(A)及SOD同工酶(B)的影響

處理CK、SNP、PEG、SNP + PEG分別為0% PEG、100 μmol L–1SNP、20% PEG和100 μmol L–1SNP + 20% PEG。

Treatments including CK, SNP, PEG, and SNP + PEG indicate 0% PEG, 100 μmol L–1SNP, 20% PEG, and 100 μmol L–1SNP + 20% PEG, respectively.

圖5 外源NO處理對(duì)干旱脅迫下玉米幼苗POD活性(A)及POD同工酶(B)的影響

處理CK、SNP、PEG、SNP + PEG分別為0% PEG、100 μmol L–1SNP、20% PEG和100 μmol L–1SNP + 20% PEG。

Treatments including CK, SNP, PEG, and SNP + PEG indicate 0% PEG, 100 μmol L–1SNP, 20% PEG, and 100 μmol L–1SNP + 20% PEG, respectively.

圖6 外源NO處理對(duì)干旱脅迫下玉米幼苗CAT活性(A)及CAT同工酶(B)的影響

處理CK、SNP、PEG、SNP + PEG分別為0% PEG、100 μmol L–1SNP、20% PEG和100 μmol L–1SNP + 20% PEG。

Treatments including CK, SNP, PEG, and SNP + PEG indicate 0% PEG, 100 μmol L–1SNP, 20% PEG, and 100 μmol L–1SNP + 20% PEG, respectively.

3 討論

光合作用是植物生命活動(dòng)過(guò)程中的重要組成部分, 已有的研究結(jié)果表明, 水分虧缺脅迫引起光合作用能力下降主要是因?yàn)榉菤饪滓蛩叵拗芠16], 與Rubisco活性和激活狀態(tài)有關(guān), 而Rubisco在植物體內(nèi)的活性取決于RCA對(duì)它的活化[5]。在水分虧缺脅迫下, Rubisco和RCA的活性下降會(huì)影響葉片的氣體交換和光合作用的正常進(jìn)行[21]。Rubisco由8個(gè)大亞基和8個(gè)小亞基組成, 大亞基由葉綠體基因L編碼, 小亞基由細(xì)胞核中的多基因家族S編碼[22]。而且不同植物RCA亞基的數(shù)量和種類也不相同, 但玉米中只發(fā)現(xiàn)了β亞基[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明, 玉米葉片Rubisco和RCA的活性及L、β基因表達(dá)量在水分虧缺時(shí)均顯著降低, 而S基因的表達(dá)量略有上升, 這與前人對(duì)水分虧缺脅迫下番茄、水稻、擬南芥等植物葉片S基因表達(dá)量急劇下降的研究結(jié)果不一致, 說(shuō)明S基因?qū)Νh(huán)境的敏感程度可能因植物種類不同而異。NO作為新型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì), 研究表明外源NO可通過(guò)上調(diào)光合碳同化過(guò)程中相關(guān)酶基因的mRNA表達(dá)水平, 提高NaCl脅迫下番茄Rubisco和RCA活性[24]。本試驗(yàn)結(jié)果也證明了外源NO能上調(diào)Rubisco和 RCA的活性及L、S、β基因表達(dá), 有利于增強(qiáng)CO2的同化效率和光合電子傳遞效率, 并促進(jìn)光反應(yīng)同化力(NADPH和ATP)的積累, 增加 RuBP固定CO2的量, 從而提高 Rubisco的羧化效率。

ROS產(chǎn)生的主要部位是在葉綠體和線粒體, 研究表明干旱條件下光合作用的下調(diào)與抗氧化酶的活性有關(guān)[25]。SOD、POD和CAT是植物組織內(nèi)重要的抗氧化酶, 它們通過(guò)清除O2-、·OH和H2O2來(lái)減少ROS對(duì)葉綠體細(xì)胞膜的傷害、減輕膜質(zhì)過(guò)氧化和穩(wěn)定膜的透性[26]。當(dāng)植物處于逆境時(shí), 體內(nèi)的抗氧化酶活性及同工酶表達(dá)升高, 是保障植物光合作用正常進(jìn)行的重要酶系統(tǒng)[27]。而在本試驗(yàn)中, 水分虧缺脅迫后, 玉米幼苗葉片僅SOD活性上升及同工酶譜帶增寬, CAT、POD活性的下降引起了ROS類物質(zhì)O2-和H2O2大量積累, 抗氧化防御系統(tǒng)作用減弱, 體內(nèi)自由基不能被完全清除而造成玉米葉片膜脂過(guò)氧化損傷, 從而導(dǎo)致了玉米光合碳同化能力下降。NO本身是一個(gè)活性氮中間體(RNS), 低濃度NO可通過(guò)各種方式與ROS作用并發(fā)揮抗氧化脅迫功能[3,10,28]。外源NO處理后抗氧化酶SOD、CAT、POD活性的提高, 及其同工酶帶寬度和亮度增強(qiáng), 表明了NO對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡和細(xì)胞膜穩(wěn)定性的調(diào)控作用, 預(yù)示著NO對(duì)植物光合作用的調(diào)節(jié)作用與其對(duì)抗ROS代謝水平的調(diào)節(jié)也密切相關(guān)。

4 結(jié)論

水分虧缺誘導(dǎo)的NO調(diào)節(jié)物質(zhì)在玉米抗旱機(jī)制中扮演著非常重要的角色, 外源NO預(yù)處理可以提高干旱脅迫條件下玉米幼苗葉片的光合碳同化能力和抗氧化酶活性, 緩解干旱脅迫對(duì)葉片光合作用的抑制。

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Effect of Exogenous Nitric Oxide Donor on Carbon Assimilation and Antioxidant System in Leaves of Maize Seedlings under PEG-induced Water Deficit Stress

YANG Qing-Hua, ZHENG Bo-Yuan, LI Lei-Lei, JIA Shuang-Jie, HAN Xin-Pei, GUO Jia-Meng, WANG Yong-Chao, and SHAO Rui-Xin*

College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450046, Henan, China

The objective of this study was to explore the effect of exogenous nitric oxide (NO) donor (sodium nitroprusside, SNP) on key enzymes of carbon assimilation and antioxidant system of maize leaves under water deficit and its regulation mechanism. In this experiment, 20% PEG-6000 was used to stimulate water deficit stress, exogenous SNP was added into root rhizosphere of seedlings in maize variety Zhuyu 309. After three days of stresses, the changes of Rubisco and RCA activities and their gene level, antioxidase activity and their isoenzyme spectrum level were investigated. The expression levels ofL,S,β were increased significantly, especially forS that was increased the most by 1.86 fold, which resulted in up-regulation of Rubisco and RCA activities by 32.7% and 14.67% under exogenous SNP plus PEG stress. In addition, SNP enhanced the activity of SOD, POD, CAT, and the width in their isoenzyme spectrum, resulting in significant reduction of ROS accumulation. These results suggested that NO could increase photosynthetic carbon assimilation capacity and antioxidase activity, alleviate the damage of ROS burst on the cell membrane, which enhances PEG-simulated water deficit resistance of maize seedlings.

exogenous nitric oxide; water deficit; maize seedlings; carbon assimilation; antioxidant system

2017-12-22;

2018-06-12;

2018-07-02.

10.3724/SP.J.1006.2018.01393

邵瑞鑫, E-mail: shao_rui_xin@126.com, Tel: 0371-56990239

E-mail: yangqh2010@163.com, Tel: 0371-56990239

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401304)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31401304).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180702.0852.002.html