甘蔗ScWRKY4基因的克隆與表達(dá)特性分析

王 玲 劉 峰 戴明劍 孫婷婷 蘇煒華 王春風(fēng) 張 旭毛花英 蘇亞春,2, 闕友雄,2,

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甘蔗基因的克隆與表達(dá)特性分析

王 玲1劉 峰1戴明劍1孫婷婷1蘇煒華1王春風(fēng)1張 旭1毛花英1蘇亞春1,2,*闕友雄1,2,*

1福建農(nóng)林大學(xué) / 農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州 350002;2福建農(nóng)林大學(xué) / 教育部作物遺傳育種與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建福州 350002

WRKY是植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子家族之一, 在植物對(duì)生物和非生物逆境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中起重要調(diào)控作用。本研究基于課題組前期構(gòu)建的甘蔗(spp.)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù), 從新臺(tái)糖22 (ROC22)中成功克隆到1個(gè)基因, 命名為(GenBank登錄號(hào)為MG852087)。序列分析發(fā)現(xiàn),基因cDNA全長(zhǎng)1265 bp, 包含1個(gè)741 bp的完整開(kāi)放讀碼框, 編碼246個(gè)氨基酸, 該蛋白具有1個(gè)WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域和C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域, 屬于IIc類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn), ScWRKY4蛋白為堿性的不穩(wěn)定親水性蛋白, 不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域, 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)元件缺少β螺旋。在本氏煙()葉片瞬時(shí)表達(dá)中, ScWRKY4蛋白定位于細(xì)胞核。酵母雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, ScWRKY4不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明,基因在甘蔗的根、葉、芽和皮中的表達(dá)量無(wú)明顯差異, 在蔗肉中的表達(dá)量最高, 為對(duì)照蔗根的18.38倍; 黑穗病菌侵染0~72 h,在抗病品種崖城05-179中下調(diào)表達(dá), 在感病品種ROC22中表達(dá)較穩(wěn)定; 受到外源激素脫落酸、水楊酸和茉莉酸甲酯以及非生物脅迫因子氯化鈉和聚乙二醇脅迫后,基因均被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。上述研究結(jié)果表明,基因可能不參與甘蔗對(duì)黑穗病的抗性反應(yīng)或在該防御方面起負(fù)調(diào)控作用, 但積極響應(yīng)甘蔗對(duì)鹽和干旱脅迫的應(yīng)答。

甘蔗; WRKY轉(zhuǎn)錄因子; 生物信息學(xué); 亞細(xì)胞定位; 轉(zhuǎn)錄激活活性; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中, 依賴(lài)其體內(nèi)各種功能基因的表達(dá)來(lái)適應(yīng)環(huán)境, 特別是在生物和非生物逆境脅迫條件下, 這些相關(guān)功能基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)和修飾就顯得尤其重要。轉(zhuǎn)錄因子又稱(chēng)反式作用因子, 可以結(jié)合在靶基因上游的順式作用元件上, 對(duì)相關(guān)功能靶基因的轉(zhuǎn)錄效率進(jìn)行正向或負(fù)向調(diào)控[1]。目前, 對(duì)植物逆境相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究較多的是WRKY、MYB (myeloblastosis)、NAC [NAM, ATAF1(2), CUC2]、bZIP (basic letcine-zipper)和AP2/ERF (APETALA 2/ethylene-responsive element binding factor)五大類(lèi)[2]。自1994年首個(gè)甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族基因(SWEET POTATO FACTORS)[3]被克隆以來(lái), 逐漸有大量的基因從多種植物中被分離鑒定。基因家族成員在模式植物擬南芥()中有72個(gè)[4]、水稻()中有105個(gè)[5]、高粱()中有68個(gè)[6]、大麥()中有45個(gè)[7]、玉米()中有119個(gè)[8]。

1996年Rushton等[9]發(fā)現(xiàn)歐芹()的WRKY轉(zhuǎn)錄因子WRKY1、WRKY2和WRKY3在基因介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中具有調(diào)控作用。擬南芥72個(gè)基因中有49個(gè)受到丁香假單胞菌()和水楊酸(salicylic acid, SA)的誘導(dǎo)表達(dá)[10]。利用全基因組分析大麥轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)圖譜發(fā)現(xiàn),和負(fù)調(diào)控大麥對(duì)白粉菌()的抗性[11]。水稻有15個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以被稻瘟病菌()誘導(dǎo)表達(dá), 其中12個(gè)能夠同時(shí)被白葉枯病菌(pv.)誘導(dǎo)表達(dá)[12]; 在水稻中過(guò)表達(dá)基因能夠顯著增強(qiáng)其對(duì)白葉枯病病菌和稻瘟病菌的抗性[13];在水稻的先天免疫過(guò)程中起負(fù)調(diào)節(jié)作用[14]。擬南芥的WRKY轉(zhuǎn)錄因子中有30個(gè)響應(yīng)鹽脅迫, 其中23個(gè)上調(diào)表達(dá), 7個(gè)下調(diào)表達(dá)[15]。菜豆()的88個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子中, 有19個(gè)受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá), 其中11個(gè)下調(diào), 8個(gè)上調(diào)[16]。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn), 楊樹(shù)()的100個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子中, 有61個(gè)受到楊樹(shù)黑斑病菌()、SA、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、損傷、冷脅迫、鹽脅迫等誘導(dǎo)表達(dá)[17]。此外, 玉米中有58個(gè)基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[18]。上述報(bào)道為研究植物轉(zhuǎn)錄因子在應(yīng)答不同生物和非生物逆境脅迫下的耐受機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

甘蔗(spp.)不僅是最重要的糖料作物, 也是最有潛力的生物能源作物, 具有重要的生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。研究甘蔗在生長(zhǎng)發(fā)育及其適應(yīng)外界環(huán)境變化過(guò)程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo), 特別是轉(zhuǎn)錄因子的功能, 對(duì)甘蔗的高產(chǎn)、高效分子育種理論具有重要的參考意義。目前, 在甘蔗上僅有1篇關(guān)于基因的研究報(bào)道[19]。Liu等[19]發(fā)現(xiàn)基因(GenBank登錄號(hào)為GQ246458)在甘蔗品種福農(nóng)22 (FN22)中的表達(dá)受甘蔗黑穗病菌()、SA、氯化鈉(sodium chloride, NaCl)和聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)的誘導(dǎo), 表明該基因可能在甘蔗對(duì)黑穗病菌、干旱和高鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制中發(fā)揮作用。本研究基于課題組前期構(gòu)建的甘蔗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù), 從甘蔗品種新臺(tái)糖22 (ROC22)中成功分離獲得1個(gè)新的甘蔗轉(zhuǎn)錄因子基因, 借助生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)了該基因的理化性質(zhì), 并驗(yàn)證了其亞細(xì)胞定位情況及轉(zhuǎn)錄激活活性, 同時(shí)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)技術(shù)分析了基因在黑穗病菌及不同植物激素和非生物脅迫下的表達(dá)水平變化, 目的是為甘蔗抗逆分子育種提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗(yàn)所用的甘蔗材料由福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供, 分別為感黑穗病品種ROC22和抗黑穗病品種崖城05-179。參照黃寧等[20]的方法, 從甘蔗田隨機(jī)帶土挖取9株健康并且長(zhǎng)勢(shì)一致的植株, 立即洗凈根部泥土, 從乳白色幼嫩的蔗根取樣; 從地面以上完整可見(jiàn)的第一節(jié)間算起, 選取第7~8節(jié)間, 用75%酒精擦凈其表皮, 從側(cè)芽、蔗皮和蔗肉取樣; 選取+1葉的蔗葉, 用酒精擦拭干凈。選擇3株作為一個(gè)重復(fù), 共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用錫箔紙包好所有材料, 立即投入液氮冷凍, –80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

為了分析目的基因在不同外源脅迫下的表達(dá)特性, 將ROC22健康植株的蔗莖砍成單芽莖段, 清洗干凈并溫水脫毒處理后, 在塑料托盆中沙培育苗3個(gè)月左右, 至其長(zhǎng)出第4或第5葉, 挑選健壯且長(zhǎng)勢(shì)一致的蔗苗, 將根清洗干凈后放入盛有清水的塑料盆中煉苗培養(yǎng)10 d, 開(kāi)始試驗(yàn)處理。第一組分別在250 mmol L–1NaCl和25.0% PEG-8000水溶液中培養(yǎng), 于處理后0、0.5、3、6和24 h進(jìn)行葉片取樣; 第二組在葉面分別噴施100 μmol L–1脫落酸(abscisic acid, ABA)、5 mmol L–1SA (含0.01%吐溫-20,)和25 μmol L–1MeJA, ABA處理在0、0.5、3、6和24 h進(jìn)行葉片取樣, SA和MeJA處理在0、3、12和24 h進(jìn)行葉片取樣。黑穗病菌處理材料為32℃培養(yǎng)箱催芽至2 cm左右的蔗芽, 針刺接種5×106個(gè) mL–1(含0.01%吐溫-20, v/v)濃度的黑穗病菌孢子懸浮液, 同時(shí), 對(duì)照以無(wú)菌蒸餾水(含0.01%吐溫-20, v/v)接種, 于28℃下16 h光照/8 h黑暗培養(yǎng), 分別于處理后0、24、48和72 h進(jìn)行蔗芽取樣。每3株作為1次生物學(xué)重復(fù), 每組設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用錫箔紙包好所有材料, 立即投入液氮冷凍, –80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 甘蔗ScWRKY4基因的克隆與生物信息學(xué)分析

利用TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取ROC22葉片總RNA, 參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, 中國(guó)上海)說(shuō)明書(shū)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA, 作為基因克隆的模板。從課題組前期構(gòu)建的甘蔗受黑穗病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)[21]中, 挖掘到一條WRKY轉(zhuǎn)錄因子的Unigene序列(轉(zhuǎn)錄本ID: c128160.graph_c0), 命名為, 利用NCBI在線軟件設(shè)計(jì)該基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物對(duì)-F/R (表1)。PCR反應(yīng)總體系為25 μL, 包含cDNA模板1.0 μL、上下游引物(10 μmol L–1)各1.0 μL、ExDNA酶(5 U μL–1) 0.125 μL、10×Ex緩沖液(Mg2+plus) 2.5 μL、dNTPs混合物(2.5 mmol L–1) 2.0 μL和ddH2O 17.375 μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性30 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 35個(gè)循環(huán); 最后72℃再延伸10 min。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 參照Gel Extraction Kit (天根, 中國(guó)北京)說(shuō)明書(shū)純化回收后, 再將其連接到pMD19-T (TaKaRa, 中國(guó)大連)克隆載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞(天根, 中國(guó)北京), 最后隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定, 并將檢測(cè)呈陽(yáng)性的菌落送至尚亞有限公司測(cè)序分析。

通過(guò)NCBI的ORF finder (https://www.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder/)在線程序和Conserved domains (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)數(shù)據(jù)庫(kù), 分析測(cè)序獲得的cDNA序列的開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)及保守功能結(jié)構(gòu)域。運(yùn)用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)和GOR IV (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html/)程序, 預(yù)測(cè)ScWRKY4蛋白的一級(jí)和二級(jí)結(jié)構(gòu)特征。利用在線程序SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)、TMHMM Server v. 2.0 (http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析基因編碼氨基酸的信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)域和磷酸化位點(diǎn)。借助Psort (http://www.psort.org/)工具預(yù)測(cè)ScWRKY4蛋白的亞細(xì)胞定位情況。采用NCBI中Blastp程序, 查找與甘蔗ScWRKY4蛋白同源的氨基酸序列, 而后利用DNAMAN 6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì), 并通過(guò)ClustalW對(duì)ScWRKY4蛋白與甘蔗Sc-WRKY[19]、大麥[7]、擬南芥[15]、玉米[22]的基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)分析, 使用MEGA 6.0軟件中的最大似然法(maximum- likelihood, ML) (1000 BootStrap)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.3 甘蔗ScWRKY4基因的亞細(xì)胞定位

根據(jù)基因克隆測(cè)序正確的序列的ORF (去除終止密碼子)和亞細(xì)胞定位載體pCAMBIA 1300-(Clontech, 中國(guó)北京)圖譜設(shè)計(jì)引物對(duì)-Subloc-F/R (表1), 以pMD19- T-質(zhì)粒為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 將其膠回收產(chǎn)物和亞細(xì)胞定位載體質(zhì)粒分別用相同的限制性?xún)?nèi)切酶H I和I (Fermentas, 中國(guó)上海)進(jìn)行雙酶切、膠回收及T4 DNA酶連接, 然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 經(jīng)菌液PCR檢測(cè)、單酶切和雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序檢測(cè)后, 得到pCAMBIA 1300-亞細(xì)胞定位融合表達(dá)載體。將pCAMBIA 1300-陽(yáng)性質(zhì)粒和pCAMBIA 1300-空載分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株GV3101 (天根, 中國(guó)北京), 添加含有50 μg mL–1卡那霉素和35 μg mL–1利福平的LB液體培養(yǎng)基, 于28℃下250 轉(zhuǎn) min–1振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。設(shè)置離心機(jī)溫度4℃、轉(zhuǎn)速4000×、時(shí)間10 min, 收集菌體, 然后重懸于MS空白培養(yǎng)基并將濃度調(diào)至OD600=0.8, 加入200 μmol L–1乙酰丁香酮后黑暗靜置30 min。選擇5~8片葉齡且長(zhǎng)勢(shì)一致的本氏煙進(jìn)行針刺注射, 在光照16 h/黑暗8 h條件下28℃培養(yǎng)2 d后, 將含有目的基因和空載的葉片剪下, 背光面朝下置1 μg mL–14’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色劑中, 37℃暗培養(yǎng)30 min, 依次用NaCl水溶液脫色和清水洗凈后, 背光面朝上置載玻片, 在Leica激光共聚焦顯微鏡(德國(guó))下觀察亞細(xì)胞定位情況[23]。

表1 引物序列及用途

下畫(huà)線為添加的酶切位點(diǎn)H I (GGATCC)、I (TCTAGA)、I (CATATG)和H I (GGATCC); 雙下畫(huà)線為添加的保護(hù)堿基。

The added restriction enzyme sites ofH I (GGATCC),I (TCTAGA),I (CATATG), andH I (GGATCC) are underlined; the added protective bases in primers are double underlined.

1.4 甘蔗ScWRKY4的自激活活性分析

參照Matchmaker Gold酵母雙雜交系統(tǒng)說(shuō)明, 采用Y2HGold-GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)(含有4個(gè)報(bào)告基因:和)分析ScWRKY4的自激活活性。根據(jù)基因克隆測(cè)序正確的序列的ORF (去除終止密碼子)和BD (DNA-binding domain)載體pGBKT7的圖譜設(shè)計(jì)引物對(duì)-BD-F/R (表1), 以pMD19-T-質(zhì)粒為模板, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 將其膠回收產(chǎn)物和pGBKT7載體質(zhì)粒分別用相同的限制性?xún)?nèi)切酶I和H I (Fermentas, 中國(guó)上海)進(jìn)行雙酶切、膠回收及T4 DNA酶連接, 轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 經(jīng)菌液PCR檢測(cè)、單酶切和雙酶切驗(yàn)證及測(cè)序比對(duì)后, 得到pGBKT7-重組載體。按照Y2HGold Chemically Competent Cell (TaKaRa, 中國(guó)大連)說(shuō)明書(shū)操作, 將200 μg pGBKT7-重組質(zhì)粒加入到100 μL酵母Y2HGold感受態(tài)細(xì)胞(全式金, 中國(guó)北京)中, 在SD/–Trp平板上29℃培養(yǎng)2~3 d, 至菌體長(zhǎng)出。挑取3個(gè)單菌落同時(shí)于含有1 mL SD/–Trp液體培養(yǎng)基的2 mL無(wú)菌離心管中, 29℃、220 r min–1搖床震蕩培養(yǎng)10 h左右, 稀釋1×10–1、1×10–2和1×10–3三個(gè)濃度梯度, 取菌液8 μL分別于SD/–Trp、SD/–Trp (+X-α-Gal)和SD/–Trp (+X-α-Gal+AbA)平板上點(diǎn)樣, 29℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng), 對(duì)長(zhǎng)出的菌落拍照記錄。以雜交載體pGBKT7-53+pGADT7-T (已明確53蛋白和T蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)能夠發(fā)生結(jié)合, 該雜交載體在含有金擔(dān)子素A (aureobasidin A, AbA)抗生素的平板上能激活報(bào)告基因)作為陽(yáng)性對(duì)照, 空載pGBKT7 (含營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記)作為陰性對(duì)照, 分別轉(zhuǎn)化Y2HGold, 并與pGBKT7-在相同平板上培養(yǎng)。通過(guò)觀察酵母生長(zhǎng)情況來(lái)判斷ScWRKY4是否具有自激活活性。

1.5 甘蔗ScWRKY4基因表達(dá)模式分析

采用TRIzol法提取甘蔗不同組織(根、芽、葉、蔗肉和蔗皮)以及經(jīng)ABA、SA、MeJA、PEG、NaCl和黑穗病菌脅迫處理樣品的葉片總RNA, 按照PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect Real Time) (TaKaRa, 中國(guó)大連)使用說(shuō)明合成第1鏈cDNA, 以15倍稀釋液作為qRT-PCR模板。在Primer Premier 5.0軟件中設(shè)計(jì)基因的qRT-PCR檢測(cè)引物-QF/R (表1), 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,) (GenBank Accession Number: CA254672)為內(nèi)參基因[25], 引物-Q/F如表1所示。采用ABI 7500 Real-time PCR System (美國(guó))進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè), 并按照SYBR Green PCR Master Mix Kit (Roche, 中國(guó)上海)說(shuō)明書(shū)配置定量反應(yīng)體系。qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)?0℃ 2 min; 95℃預(yù)變性10 min; 95℃變性15 s, 60℃退火延伸1 min, 40個(gè)循環(huán); 增加熔解曲線, 95℃ 15 s, 60℃ 1 min, 95℃ 15 s, 60℃ 15 s。每個(gè)樣品設(shè)置3次技術(shù)重復(fù), 陰性對(duì)照以無(wú)菌水作模板。采用2–ΔΔCt [26]計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量, 利用DPS 9.50軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性水平, 并用Origin 8.0軟件作柱狀圖。在黑穗病菌接種試驗(yàn)中, 由于目標(biāo)基因的表達(dá)量會(huì)受到機(jī)械損傷的影響, 參照蘇亞春等[27]的方法, 用接種黑穗病病原菌材料中基因的表達(dá)量減去對(duì)應(yīng)時(shí)間接種無(wú)菌水材料中的表達(dá)量作為其相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗ScWRKY4基因的克隆

以甘蔗ROC22的葉片cDNA為模板、-F/R為PCR引物, 擴(kuò)增到約1265 bp的單一條帶(圖1)。該擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與載體pMD19-T連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞, 經(jīng)菌液PCR檢測(cè)和測(cè)序鑒定, 得到圖2序列。ORF finder分析顯示,基因的ORF (137~877 bp)全長(zhǎng)為741 bp, 編碼246個(gè)氨基酸。

圖1 甘蔗ScWRKY4基因的PCR擴(kuò)增

M: 15000+2000 bp DNA marker; 1: PCR產(chǎn)物。

M: 15000+2000 bp DNA marker; 1: PCR product.

圖2 PCR擴(kuò)增獲得的ScWRKY4基因的核酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列(*: 終止密碼子)

紅色框部分為WRKYGQK基序; 黑色框部分為C2H2基序(CX4CX23HXH)。

The sequence of WRKYGQK motif is highlighted in red box, and that of C2H2motif (CX4CX23HXH) in black box.

2.2 甘蔗ScWRKY4基因的生物信息學(xué)分析

利用生物學(xué)軟件對(duì)Sc基因序列編碼的蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè), 發(fā)現(xiàn)該蛋白的分子式為C1166H1794N332O365S15, 理論分子量為26 767.4 Da, 平均疏水性(GRAVY)為–0.49, 不穩(wěn)定系數(shù)(II)為42.69, 負(fù)電荷殘基(Asp+Glu) 22個(gè), 正電荷殘基(Arg+Lys) 28個(gè), 等電點(diǎn)為8.71, 推測(cè)ScWRKY4蛋白為一個(gè)親水性的不穩(wěn)定堿性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示甘蔗ScWRKY4蛋白主要由無(wú)規(guī)則卷曲(70.73%)、α-螺旋(17.48%)和延伸鏈(11.79%)結(jié)構(gòu)組成, 而缺少β-螺旋結(jié)構(gòu)。另外, 預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ScWRKY4蛋白不具有信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果顯示ScWRKY4蛋白含有12個(gè)絲氨酸(serine)、8個(gè)蘇氨酸(threonine)和2個(gè)酪氨酸(tyrosine), 推測(cè)這些位點(diǎn)上可能發(fā)生磷酸化反應(yīng), 從而對(duì)ScWRKY4蛋白的活性與功能產(chǎn)生調(diào)控作用。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn), 甘蔗ScWRKY4蛋白位于細(xì)胞核的概率最大, 為73.9%。從圖3可以看出, 甘蔗基因編碼蛋白包含一個(gè)從第166~223位的WRKY保守結(jié)構(gòu)域, 確定該蛋白屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族。采用NCBI中的BlastP在線程序, 查找ScWRKY4的同源氨基酸序列, 結(jié)果顯示ScWRKY4蛋白與高粱SbWRKY57 (XP_002448267.2)、玉米ZmWRKY36 (NP_001151912.1)、II型少花古爾德草() DoWWRKY12 (OEL21317.1)、谷子() SiWRKY12 (XP_ 004956420.1)和水稻OsWRKY12 (XP_015635033.1)的相似性分別為88%、85%、82%、79%和68%, 其WRKY結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列高度保守, 而在其他位置的多肽序列由于物種的差異而表現(xiàn)出較大的變化(圖4)。參考前人報(bào)道的WRKY蛋白[7,15,22], 將ScWRKY4蛋白序列與甘蔗、大麥、擬南芥、玉米中不同家族類(lèi)別的WRKY蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5), 表明ScWRKY4與擬南芥AtWRKY12和AtWRKY13等聚在同一分支上, 屬于WRKY家族中的IIc亞家族。

圖3 甘蔗ScWRKY4蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析

圖4 甘蔗ScWRKY4與其他植物WRKY蛋白的氨基酸序列比對(duì)

高粱: SbWRKY57 (XP_002448267.2); 玉米: ZmWRKY36 (NP_001151912.1); II型少花古爾德草: DoWWRKY12 (OEL21317.1); 谷子: SiWRKY12 (XP_004956420.1); 二穗短柄草: BdWRKY12 (XP_014751531.1); 水稻: OsWRKY12 (XP_015635033.1)。

: SbWRKY57 (XP_002448267.2);: ZmWRKY36 (NP_001151912.1);: DoWWRKY12 (OEL21317.1);: SiWRKY12 (XP_004956420.1);: BdWRKY12 (XP_014751531.1);OsWRKY12 (XP_015635033.1).

圖5 ScWRKY4蛋白與甘蔗及其他植物WRKY蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 甘蔗ScWRKY4基因的亞細(xì)胞定位分析

亞細(xì)胞定位表達(dá)載體35S::GFP和融合質(zhì)粒35S::ScWRKY4::GFP分別用相同的內(nèi)切酶H I和I進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證, 結(jié)果如圖6-A所示。采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及注射本氏煙葉片的方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位觀察, 陽(yáng)性對(duì)照35S::GFP在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜上都有綠色熒光分布, 而35S::ScWRKY4::GFP融合蛋白只在細(xì)胞核中有很強(qiáng)的綠色熒光(圖6-B), 表明35S::ScWRKY4::GFP融合蛋白定位于細(xì)胞核中。

2.4 甘蔗ScWRKY4的自激活活性分析

重組質(zhì)粒pGBKT7-經(jīng)酶切驗(yàn)證及測(cè)序分析, 初步顯示酵母融合表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖7-A)。利用Y2HGold-GAL4酵母雙雜交系統(tǒng)對(duì)ScWRKY4的自激活活性分析表明, 在SD/–Trp平板上, pGBKT7-與陽(yáng)性對(duì)照pGADT7+ pGBKT7-p53和陰性對(duì)照pGBKT7一致, 均能長(zhǎng)出菌落, 說(shuō)明pGBKT7-重組質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入Y2HGold中, 且GAL4-BD與ScWRKY4蛋白結(jié)合, 能成功表達(dá)色氨酸。在添加X(jué)-α-Gal的SD/–Trp平板上發(fā)現(xiàn), 由于陽(yáng)性對(duì)照中基因被激活, X-α-Gal檢測(cè)顯藍(lán)色, 而pGBKT7-與陰性對(duì)照均不顯藍(lán)色, 說(shuō)明ScWRKY4沒(méi)有自激活活性。經(jīng)過(guò)AbA抗性篩選, 陽(yáng)性對(duì)照可正常生長(zhǎng), 且X-α-Gal檢測(cè)顯藍(lán)色, 表明報(bào)告基因和基因都被激活, 而pGBKT7-和陰性對(duì)照一樣, 均不能正常生長(zhǎng), 進(jìn)一步說(shuō)明ScWRKY4蛋白不具有自激活活性(圖7-b)。

2.5 ScWRKY4基因的組織特異性表達(dá)分析

基因在甘蔗ROC22不同組織中的表達(dá)分析結(jié)果顯示, 該基因在根、芽、葉和皮中的表達(dá)量差異不顯著, 但在蔗肉中的表達(dá)量最高, 為對(duì)照蔗根中表達(dá)量的18.38倍(圖8)。

2.6 ScWRKY4基因在不同外源脅迫下的表達(dá)特性分析

2.6.1基因在黑穗病菌侵染下的表達(dá)特性 黑穗病菌侵染24 h時(shí), S基因在崖城05-179中的表達(dá)量顯著下調(diào)至對(duì)照組的0.20倍, 隨后穩(wěn)定在同一表達(dá)水平。而在ROC22中, 該基因在受黑穗病菌侵染72 h內(nèi)的表達(dá)量與對(duì)照組相比, 并無(wú)顯著差異(圖9)。

圖6 甘蔗ScWRKY4亞細(xì)胞定位分析

(A) 35S::ScWRKY4::GFP亞細(xì)胞定位重組載體的酶切驗(yàn)證結(jié)果。1: 15000+2000 bp DNA marker; 2: 35S::GFP/I; 3:ORF PCR產(chǎn)物; 4: 35S::ScWRKY4::GFP/I; 5: 35S::ScWRKY4::GFP/IHI; 6: 100 bp ladder DNA marker。(B)農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的及空載體注射本氏煙葉片48 h的亞細(xì)胞定位結(jié)果。本氏煙葉片表皮細(xì)胞被用于明場(chǎng)、綠色熒光、藍(lán)色熒光、明場(chǎng)和綠色及藍(lán)色熒光疊加后的圖像分析; 白色箭頭1、2和3分別表示質(zhì)膜、細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì), 比例尺=25 μm; 35S::GFP: 攜帶空載pCAMBIA 1300-的農(nóng)桿菌菌株; 35S::ScWRKY4::GFP: 攜帶重組載體pCAMBIA 1300--的農(nóng)桿菌菌株; DAPI: 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚。

(A) The enzyme digestion to identify the insert-integrated subcellular localization expression vector 35S::ScWRKY4::GFP. 1: 15000+2000 bp DNA marker; 2: 35S::GFP/I; 3:ORF PCR product; 4: 35S::ScWRKY4::GFP/I; 5: 35S::ScWRKY4::GFP/I+HI; 6: 100 bp ladder DNA marker. (B) Subcellular localizations of themediated transformation ofand empty vector inleaves 48 h after infiltration. The epidermal cells ofwere used for taking images of visible light, green fluorescence, blue fluorescence, merged visible light and green fluorescence and blue fluorescence; white arrows 1, 2, and 3 indicate plasma membrane, nucleus and cytoplasm, respectively; scale bar = 25 μm; 35S::GFP: thestrain carrying the empty vector pCAMBIA 1300-; 35S::ScWRKY4::GFP: thestrain carrying the recombinant vector pCAMBIA 1300--; DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindole.

2.6.2基因在不同植物激素和非生物脅迫下的表達(dá)特性 在SA和MeJA處理下,基因的表達(dá)水平均高于對(duì)照組, 其中SA處理12 h時(shí)達(dá)到峰值, 為對(duì)照組的2.69倍, MeJA處理12 h時(shí)達(dá)到峰值, 為對(duì)照組的2.38倍。ABA脅迫下,基因的表達(dá)量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)存在顯著變化, 0.5 h時(shí)該基因顯著上調(diào)至對(duì)照組的1.59倍, 3 h時(shí)恢復(fù)到對(duì)照組水平, 6 h時(shí)達(dá)到峰值且為對(duì)照組的2.87倍, 隨后在24 h時(shí)表達(dá)量有所下調(diào), 但仍高于對(duì)照(1.26倍)。經(jīng)NaCl處理,基因的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì), 在24 h時(shí)達(dá)到峰值, 其表達(dá)量為對(duì)照組的4.91倍。PEG處理下,基因的表達(dá)量在3 h時(shí)達(dá)到高峰, 為對(duì)照組12.10倍, 而在該時(shí)間點(diǎn)前后, 該基因的表達(dá)水平與對(duì)照組相比沒(méi)有明顯差異(圖10)。總體上看,基因?qū)A、MeJA、ABA、NaCl和PEG脅迫都有一定程度的應(yīng)答。

圖7 甘蔗ScWRKY4轉(zhuǎn)錄激活活性分析

(A) pGBKT7-重組載體的酶切驗(yàn)證結(jié)果。1: 15000+2000 bp DNA marker; 2: pGBKT7/I; 3:ORF PCR產(chǎn)物; 4: pGBKT7-I; 5: pGBKT7-IHI; 6: 2000 bp ladder DNA marker。(B) ScWRKY4轉(zhuǎn)錄激活活性驗(yàn)證。SD/–Trp: 色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板培養(yǎng)基; SD/–Trp (+ X-α-Gal): 色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板培養(yǎng)基(添加5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷); SD/–Trp (+ X-α-Gal+AbA): 色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板培養(yǎng)基(添加5-溴-4-氯-3-吲哚-α-D-半乳糖苷和金擔(dān)子素A)。

(A) The enzyme digestion to identify the insert-integrated vector pGBKT7. 1: 15000+2000 bp DNA marker; 2: pGBKT7/I; 3:ORF PCR product; 4: pGBKT7-I; 5: pGBKT7-IHI; 6: 2000 bp ladder DNA marker. (B) The test of transactivation activity assay of ScWRKY4. SD/–Trp: synthetic dropout medium plate; SD/–Trp (+ X-α-Gal): synthetic dropout medium plate without tryptophan (plus 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside); SD/–Trp (+ X-α-Gal+ AbA): synthetic dropout medium plate without tryptophan (plus 5-bromo-4-chloro-3-indoxyl-α-D-galactopyranoside and aureobasidin A).

圖8 ScWRKY4基因在甘蔗ROC22組織中的表達(dá)情況

柱上不同的小寫(xiě)字母代表顯著性的差異(≤ 0.05);= 3; 內(nèi)參基因?yàn)楦视腿?3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,); R: 蔗根; B: 蔗芽; L: 蔗葉; SP: 蔗肉; SE: 蔗皮。

Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different (≤ 0.05);= 3; Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase () was used as a reference gene; R: root; B: bud; L: leaf; SP: stem pith; SE: stem epidermis.

圖9 甘蔗ScWRKY4基因在黑穗病侵染下的表達(dá)情況

Yacheng 05-179: 甘蔗抗黑穗病品種; ROC22: 甘蔗感黑穗病品種。柱上不同的小寫(xiě)字母代表顯著性的差異(≤ 0.05);= 3; 內(nèi)參基因?yàn)楦视腿?3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,)。

Yacheng 05-179: smut-resistant sugarcane variety; ROC22: smut-susceptible sugarcane variety. Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different (≤ 0.05);= 3; Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase () was used as a reference gene.

圖10 甘蔗ScWRKY4基因在不同植物激素和非生物脅迫下的表達(dá)水平

柱上不同的小寫(xiě)字母代表顯著性的差異(≤ 0.05);= 3; 內(nèi)參基因?yàn)楦视腿?3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,); SA: 水楊酸(5 mmol L–1); MeJA: 茉莉酸甲酯(25 μmol L–1); NaCl: 氯化鈉(模擬鹽脅迫) (250 mmol L–1); PEG: 聚乙二醇(模擬干旱脅迫) (25.0%); ABA: 脫落酸(100 μmol L–1)。

Bars superscripted by different lowercase letters are significantly different (≤ 0.05);= 3; Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase () was used as a reference gene; SA: salicylic acid (5 mmol L–1); MeJA: methyl jasmonate (25 μmol L–1); NaCl: sodium chloride (simulating salt stress) (250 mmol L–1); PEG: polyethylene glycol (simulating drought treatment) (25.0%); ABA: abscisic acid (100 μmol L–1).

3 討論

甘蔗是食糖總產(chǎn)占比最大的糖料作物, 同時(shí)也是可再生能源作物[28]。但是甘蔗在生產(chǎn)上常受到各種病害以及低溫、干旱、高鹽等非生物環(huán)境的影響, 導(dǎo)致其生物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降, 挖掘抗逆相關(guān)基因, 有助于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)定向改良甘蔗品種的抗性[29]。當(dāng)植物處于逆境環(huán)境時(shí), 可以通過(guò)體內(nèi)功能基因的表達(dá)變化來(lái)適應(yīng)環(huán)境, 而轉(zhuǎn)錄因子對(duì)功能基因的表達(dá)和修飾起著重要的調(diào)控作用[4,6]。目前, 在甘蔗中, 與生物和非生物脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其相關(guān)基因已有報(bào)道[30]。其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究?jī)H有一例-報(bào)道[19]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子包含WRKY蛋白結(jié)構(gòu)域, 由60個(gè)左右的氨基酸殘基組成, 可與DNA域結(jié)合, 且其N(xiāo)-末端有一個(gè)高度保守的核心序列WRKYGQK, C-末端則包含有鋅指結(jié)構(gòu)域[3]。根據(jù)WRKY蛋白所含有的WRKY結(jié)構(gòu)域的個(gè)數(shù)和鋅指結(jié)構(gòu)的特點(diǎn), 可將WRKY家族分為三類(lèi), 不同亞類(lèi)可能反映其不同的功能, 其中第I類(lèi)包含有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)C2H2(Cx4-5Cx22-23HxH); 第II類(lèi)含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)C2H2(Cx4-5Cx22-23HxH), 根據(jù)其WRKY保守域外的保守結(jié)構(gòu)序列特征, 又分IIa-IIe共5個(gè)亞類(lèi); 第III類(lèi)含1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域, 鋅指結(jié)構(gòu)類(lèi)型為C2HC (Cx7Cx23HxH)[30]。研究發(fā)現(xiàn), 高度保守七肽序列WRKYGQK也并非完全保守, 如水稻中的高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域, 共有9種變異類(lèi)型, 其中較常見(jiàn)的為WRKYGEK和WRKYGKK[31]。已報(bào)道的甘蔗Sc-WRKY蛋白含有一個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域, 且存在變異, 為WRKYGKK類(lèi)型, 鋅指結(jié)構(gòu)為Cx4Cx23HxH[19]。在本研究中,基因編碼蛋白與Sc-WRKY的氨基酸序列一致性?xún)H為24.65%, 但其WRKY保守結(jié)構(gòu)域七肽序列為普遍存在的WRKYGQK類(lèi)型, 鋅指結(jié)構(gòu)與Sc-WRKY相同, 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示兩者都屬于第IIc類(lèi)WRKY轉(zhuǎn)錄因子, 推測(cè)Sc-WRKY和ScWRKY4可能具有某些相似的功能。

蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能與其在細(xì)胞中的定位緊密相關(guān)。向小華等[32]對(duì)普通煙草中的164個(gè)NtWRKY轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析, 發(fā)現(xiàn)其中有118個(gè)定位于細(xì)胞核, 主要為第I類(lèi)和第II類(lèi)WRKY家族成員, 而第III類(lèi)家族成員中, 有77.4%定位于細(xì)胞質(zhì)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn), ScWRKY4蛋白位于細(xì)胞核的概率最大, 為73.9%。本研究在本氏煙草葉片中對(duì)甘蔗ScWRKY4進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析, 發(fā)現(xiàn)其定位在細(xì)胞核, 與生物學(xué)軟件及向小華等[32]的預(yù)測(cè)結(jié)果一致, 說(shuō)明ScWRKY4可能作為核蛋白發(fā)揮作用。大部分WRKY轉(zhuǎn)錄因子的典型特征之一是具有轉(zhuǎn)錄激活活性, 但有些WRKY轉(zhuǎn)錄因子并不具有轉(zhuǎn)錄激活活性, 如大豆GmWRKY7、GmWRKY8、GmWRKY13和GmWRKY15轉(zhuǎn)錄因子在酵母中都無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性[33]。香蕉() MaWRKY11蛋白有2個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域, N端具有轉(zhuǎn)錄自激活活性, 而C端沒(méi)有[34]。沒(méi)有自激活活性的轉(zhuǎn)錄因子序列可作為誘餌, 在cDNA文庫(kù)中篩選與之互作的功能基因, 有助于進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)外界信號(hào)過(guò)程中的作用。GmWRKY7能夠與其下游功能基因的啟動(dòng)子相結(jié)合, 通過(guò)抑制基因的表達(dá)來(lái)影響大豆對(duì)鋁毒害的響應(yīng)[33]。除此之外, WRKY不僅作為轉(zhuǎn)錄因子起作用, 還可能具有信號(hào)傳遞功能, 參與到植物對(duì)外界脅迫信號(hào)的傳遞過(guò)程中[35]。本研究通過(guò)酵母體內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活試驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)ScWRKY4轉(zhuǎn)錄因子不具有自激活活性, 該研究結(jié)果有待在植物系統(tǒng)上作進(jìn)一步鑒定, 關(guān)于ScWRKY4轉(zhuǎn)錄因子對(duì)下游基因的表達(dá)調(diào)控作用仍有待研究。

前人研究表明, 普通煙草中的基因, 大多數(shù)在根、莖和葉等不同組織中具有不同程度的表達(dá)[32]。本研究發(fā)現(xiàn),在甘蔗ROC22的根、芽、葉、肉、皮中均有表達(dá), 且在蔗肉中的表達(dá)量最高, 說(shuō)明在甘蔗中的表達(dá)具有組成型表達(dá)特性。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)生物和非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)中具有重要作用。有些WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物對(duì)病原菌等生物侵染的基礎(chǔ)防御過(guò)程中起負(fù)調(diào)節(jié)作用, 如擬南芥中過(guò)表達(dá)或, 使得與抗病防御相關(guān)的基因的表達(dá)量下調(diào)[36]。Liu等[19]發(fā)現(xiàn)-基因在FN22中的表達(dá)受黑穗病菌的誘導(dǎo), 說(shuō)明-基因在對(duì)黑穗病菌侵染的防御反應(yīng)中具有積極作用。本研究中的與-同屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中的第IIc類(lèi), 然而, 研究發(fā)現(xiàn), 受黑穗病菌侵染后,基因在抗病甘蔗材料崖城05-179中表現(xiàn)出下調(diào)的趨勢(shì), 在感病品種ROC22中不受該病原菌誘導(dǎo)表達(dá), 推測(cè)可能不參與甘蔗對(duì)黑穗病的抗性反應(yīng)或在該防御系統(tǒng)中起負(fù)調(diào)控作用, 暗示隸屬于相同基因亞族的與-, 可能在響應(yīng)黑穗病菌脅迫方面存在功能的分化?；蛟赟A和MeJA處理下的表達(dá)量均高于對(duì)照水平, 且該基因均能被ABA、NaCl和PEG脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。甘蔗-基因也受SA、NaCl、PEG等誘導(dǎo)表達(dá)[19]。研究結(jié)果表明,可能參與了甘蔗對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。同樣, 水稻的表達(dá)水平在PEG、NaCl和ABA脅迫處理后均可提高, 并通過(guò)ABA途徑提高對(duì)滲透脅迫的耐受能力[37]。擬南芥在ABA處理下誘導(dǎo)表達(dá), 并參與到由ABA介導(dǎo)的信號(hào)途徑中,積極響應(yīng)對(duì)干旱的耐受性[38]。

4 結(jié)論

從甘蔗ROC22中成功分離到1個(gè)基因, 該基因長(zhǎng)1265 bp, 包含1個(gè)741 bp的ORF, 編碼246個(gè)氨基酸, 含1個(gè)WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域和C2H2(CX4CX23HXH)鋅指結(jié)構(gòu)域, 屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的IIc亞類(lèi)。ScWRKY4蛋白為堿性的不穩(wěn)定親水性蛋白, 不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域; 其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)元件缺少β螺旋結(jié)構(gòu); 包含有22個(gè)磷酸化位點(diǎn)。ScWRKY4被定位于細(xì)胞核, 不具有自激活活性?；虮磉_(dá)量在蔗肉中最高, 而在其他組織中差異不大; 該基因在甘蔗抗病品種崖城05-179與黑穗病菌互作過(guò)程中下調(diào)表達(dá), 在感病品種ROC22中的表達(dá)水平較為穩(wěn)定, 但在外源激素SA、MeJA和ABA以及非生物脅迫因子NaCl和PEG處理?xiàng)l件下均被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá), 暗示基因不參與甘蔗對(duì)黑穗病的抗性反應(yīng)或在該防御系統(tǒng)起負(fù)調(diào)控作用, 并且有可能參與到甘蔗對(duì)鹽脅迫及干旱脅迫的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中。

[1] Porto M S, Pinheiro M P N, Batista V G L, Santos R C D, Filho P A M, Lima L M. Plant promoters: an approach of structure and function., 2014, 56: 38–49

[2] 李田, 孫景寬, 劉京濤. 植物轉(zhuǎn)錄因子家族在耐鹽抗旱調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用. 生命科學(xué), 2015, 27: 217–227 Li T, Sun J K, Liu J T. Role of different transcription factor families in the regulatory networks of drought and salinity tolerance in plants., 2015, 27: 217–227 (in Chinese with English abstract)

[3] Ishiguro S, Nakamura K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein,, that recognizes SP8 sequences in the 5’ upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato., 1994, 244: 563–571

[4] Eulgem T, Somssich I E. Networks of WRKY transcription factors in defense signaling., 2007, 10: 366–371

[5] Song Y, Ai C R, Jing S J, Yu D Q. Research progress on function analysis of ricegenes., 2010, 17: 60–72

[6] Pandey S P, Somssich I E. The role of WRKY transcription factors in plant immunity., 2009, 150: 1648–1655

[7] Mangelsen E, Kilian J, Berendzen K W, Kolukisaoglu ü H, Harter K, Jansson C, Wanke D. Phylogenetic and comparative gene expression analysis of barley () WRKY transcription factor family reveals putatively retained functions between monocots and dicots., 2008, 9: 194

[8] Wei K F, Chen J, Chen Y F, Wu L J, Xie D X. Molecular phylogenetic and expression analysis of the complete WRKY transcription factor family in maize., 2012, 19: 153–164

[9] Rushton P J, Torres J T, Parniske M, Parniske M, Wernert P, Hahlbrock K, Somssich L M. Interaction of elicitor-induced DNA-binding proteins with elicitor response elements in the promoters of parsleygenes., 1996, 15: 5690–5700

[10] Dong J, Chen C H, Chen Z X. Expression profiles of thegene superfamily during plant defense response., 2003, 51: 21–37

[11] Liu D L, Leib K, Zhao P Y, Kogel K H, Langen G. Phylogenetic analysis of barley WRKY proteins and characterization ofand repressors of the pathogen-inducible gene., 2014, 289: 1331–1345

[12] Ramamoorthy R, Jiang S Y, Kumar N, Venkatesh P N, Ramachandran S. A comprehensive transcriptional profiling of thegene family in rice under various abiotic and phytohormone treatments., 2008, 49: 865–879

[13] Qiu D, Xiao J, Xie W B, Liu H B, Li X H, Xiong L Z, Wang S P. Rice gene network inferred from expression profiling of plants overexpressing, a positive regulator of disease resistance., 2008, 1: 538–551

[14] Peng Y, Bartley L E, Chen X W, Dardick C, Chern M, Ruan R, Canlas P E, Ronald P C.is a negative regulator of basal and-mediated defense againstpv.in rice., 2008, 1: 446–458

[15] 魏曉愛(ài), 姚文靜, 姜廷波, 周博如. 擬南芥基因家族應(yīng)答非生物脅迫基因的鑒定. 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 44(10): 45–48 Wei X A, Yao W J, Jiang T B, Zhou B R. Identification ofgene in response to abiotic stress fromtranscirption factor gene family of., 2016, 44(10): 45–48 (in Chinese with English abstract)

[16] Wu J, Chen J B, Wang L F, Wang S M. Genome-wide investigation of WRKY transcription factors involved in terminal drought stress response in common bean., 2017, 8: 380

[17] Jiang Y Z, Duan Y J, Jia Y, Ye S L, Zhu J R, Zhang F Q, Lu W X, Fan D, Luo K M. Genome-wide identification and characterization of theWRKY transcription factor family and analysis of their expression in response to biotic and abiotic stresses., 2014, 65: 6629–6644

[18] Zhang T, Tan D, Zhang L, Zhang X, Han Z. Phylogenetic analysis and drought-responsive expression profiles of thetranscription factor family in maize., 2017, 3: 99–108

[19] Liu J X, Que Y X, Guo J L, Xu L P, Wu J Y, Chen R K. Molecular cloning and expression analysis of a WRKY transcription factor in sugarcane., 2012, 11: 6434–6444

[20] 黃寧, 張玉葉, 凌輝, 羅俊, 吳期濱, 闕友雄. 甘蔗二氨基庚二酸異構(gòu)酶基因的克隆與表達(dá)分析. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2013, 34: 2200–2208 Huang N, Zhang Y Y, Ling H, Luo J, Wu Q B, Que Y X. Cloning and expression analysis of a diaminopimelate epimerase gene in sugarcane., 2013, 34: 2200–2208 (in Chinese with English abstract)

[21] Que Y X, Su Y C, Guo J L, Wu Q B, Xu L P. A global view of transcriptome dynamics duringchallenge in sugarcane by RNA-Seq., 2014, 9: e106476

[22] Wei K, Chen J, Chen Y F, Wu L J, Xie D X. Multiple-strategy analyses ofsubgroups and functional exploration ofgenes in pathogen responses., 2012, 8: 1940–1949

[23] 蘇亞春. 甘蔗應(yīng)答黑穗病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組與蛋白組研究及抗性相關(guān)基因挖掘. 福建農(nóng)林大學(xué)博士學(xué)位論文, 福建福州, 2014 Su Y C. Transcriptomics and Proteomics of Sugarcane Response toInfection and Mining of Resistance-Related Genes. PhD Dissertation of Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian, China, 2014 (in Chinese with English abstract)

[24] Zhou X J, Yan S W, Sun C, Li S Z, Li J, Xu M Y, Liu X Q, Zhang S J, Zhao Q Q, Li Y, Fan Y L, Chen R M, Wang L. A maize jasmonate zim-domain protein, ZmJAZ14, associates with the JA, ABA, and GA signaling pathways in transgenic., 2015, 10: e0121824

[25] 闕友雄, 許莉萍, 徐景升, 張積森, 張木清, 陳如凱. 甘蔗基因表達(dá)定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2009, 30: 274–278 Que Y X, Xu L P, Xu J S, Zhang J S, Zhang M Q, Chen R K. Reference gene selection in quantitative PCR analysis of gene expression in sugarcane., 2009, 30: 274–278 (in Chinese with English abstract)

[26] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCTmethod., 2001, 25: 402–408

[27] 蘇亞春, 王竹青, 李竹, 劉峰, 許莉萍, 闕友雄, 戴明劍, 陳允浩. 甘蔗過(guò)氧化物酶基因的克隆與功能鑒定. 作物學(xué)報(bào), 2017, 43: 510–521 Su Y C, Wang Z Q, Li Z, Liu F, Xu L P, Que Y X, Dai M J, Chen Y H. Molecular cloning and functional identification of peroxidase genein sugarcane., 2017, 43: 510–521 (in Chinese with English abstract)

[28] Yadav R L, Solomon S. Potential of developing sugarcane by-product based industries in India., 2006, 8: 104–111

[29] 付瑜華, 盧加舉, 李向勇. 甘蔗主要病害抗病遺傳育種研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2014, 45(2): 1–6 Fu Y H, Lu J J, Li X Y. Progress on disease-resistant breeding of major diseases in sugarcane., 2014, 45(2): 1–6 (in Chinese with English abstract)

[30] Eulgem T, Rushton P J, Robatzek S, Somssich I E. The WRKY superfamily of plant transcription factor., 2000, 5: 199–206

[31] Zhang Y J, Wang L J. The WRKY transcription factor superfamily: its origin in eukaryotes and expansion in plants., 2005, 5: 1–12

[32] 向小華, 吳新儒, 晁江濤, 楊明磊, 楊帆, 陳果, 劉貫山, 王元英. 普通煙草基因家族的鑒定及表達(dá)分析. 遺傳, 2016, 38: 840–856 Xiang X H, Wu X R, Chao J T, Yang M L, Yang F, Chen G, Liu G S, Wang Y Y. Genome-wide identification and expression analysis of thegene family in common tobacco (L.).(Beijing), 2016, 38: 840–856 (in Chinese with English abstract)

[33] 彭俊楚. 大豆基因的克隆和功能研究. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文, 廣東廣州, 2016 Peng J C. Isolation and Function Analysis of Soybeans. PhD Dissertation of South China Agricultural University, Guangzhou, Guangdong, China, 2016 (in Chinese with English abstract)

[34] 徐群剛, 鄺健飛, 單偉, 陸旺金, 陳建業(yè). 香蕉果實(shí)冷脅迫相關(guān)MaWRKY11轉(zhuǎn)錄因子的特性、互作蛋白篩選與鑒定. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào), 2015, 23: 543–552 Xu Q G, Kuang J F, Shan W, Lu W J, Chen J Y. Characterization and interacting-protein identification of MaWRKY11 transcription factor related to cold stress from banana fruits., 2015, 23: 543–552 (in Chinese with English abstract)

[35] Jing J J, Ma S, Ye N H, Jing M, Cao J S, Zhang J H. WRKY transcription factors in plant responses to stresses., 2017, 59: 86–101

[36] Kim K C, Lai Z, Fan B, Chen Z.WRKY38 and WRKY62 transcription factors interact with histone deacetylase 19 in basal defense., 2008, 20: 2357–2371

[37] Song Y, Jing S J, Yu D Q. Overexpression of the stress-induced, improves osmotic stress tolerance in., 2009, 54: 4671–4678

[38] Ren X, Chen Z, Liu Y, Zhang H R, Zhang M, Liu Q, Hong X H, Zhu J K, Gong Z Z. ABO3, a WRKY transcription factor, mediates plant responses to abscisic acid and drought tolerance in., 2010, 63: 417–429

Cloning and Expression Characteristic Analysis ofGene in Sugarcane

WANG Ling1, LIU Feng1, DAI Ming-Jian1, SUN Ting-Ting1, SU Wei-Hua1, WANG Chun-Feng1, ZHANG Xu1, MAO Hua-Ying1, SU Ya-Chun1,2,*, and QUE You-Xiong1,2,*

1Key Laboratory of Sugarcane Biology and Genetic Breeding (Fujian), Ministry of Agriculture / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;2Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding and Comprehensive Utilization, Ministry of Education / Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China

WRKY is one of the specific transcriptional regulators in plants and widely involved in the response of plants to diverse biotic and abiotic stresses. In this study, based on our previous transcriptome data of sugarcane (spp.), we successfully cloned agene from sugarcane variety ROC22, named as(GenBank accession number MG852087). Sequence analysis showed that the full-length cDNA ofgene was 1265 bp, containing a 741 bp complete open reading frame and encoding 246 amino acids residues. ScWRKY4 protein had a conservative WRKYGQK domain and a zinc finger motif C2H2, belonging to IIc subgroup of WRKY transcription factor family. Bioinformatics analysis indicated that ScWRKY4 was an alkaline unstable hydrophilic protein with no signal peptide and transmembrane structure. The secondary structural element of ScWRKY4 protein was lack of beta helix structure. ScWRKY4 was located in the nucleus after transient expression in. The result of yeast hybridization experiment demonstrated that ScWRKY4 did not possess transcriptional activity. Real-time fluorescent quantitative PCR showed that the expression ofgene had no significant difference in root, leaf, bud and stem epidermis, while had the highest expression level in stem pith, which was 18.38 times higher than that in root. During inoculation with smut pathogen () at 0–72 h, the gene expression level ofwas down-regulated in sugarcane smut-resistant cultivar Yacheng 05-179, while was more stable in the susceptible one ROC22. The transcript ofwas up-regulated by exogenous hormone stresses of abscisic acid, salicylic acid, and methyl jasmonate, as well as by the abiotic treatments of sodium chloride and polyethylene glycol. These results suggest thatgene may not participate in sugarcane smut resistance, or only play a negative role in this defense reaction, but positively involve in the response mechanism of salt and drought resistance in sugarcane.

sugarcane; WRKY transcription factor; bioinformatics; subcellular localization; transcriptional activity; real-time flourescent quantitative PCR

2018-01-28;

2018-06-12;

2018-07-02.

10.3724/SP.J.1006.2018.01367

蘇亞春, E-mail: syc2009mail@163.com; 闕友雄, E-mail: queyouxiong@126.com

E-mail: lingw2017@126.com

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31671752和31101196), 福建省杰出青年基金項(xiàng)目(2015J06006), 福建省高校杰出青年科研人才計(jì)劃項(xiàng)目(蘇亞春-2017)和國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-17)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31671752, 31101196), the Natural Science Foundation of Fujian Province for Distinguished Young Scholars (2015J06006), the Research Funds for Distinguished Young Scientists in Fujian Provincial Department of Education (SYC-2017), and China Agriculture Research System (CARS-17).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180630.1120.002.html