小麥CBL 4基因密碼子使用特征分析

陳文燁，焦義然，楊軍峰，劉永偉，楊 帆，董福雙，王海波，杜進民，周 碩*

(1.河北科技大學 生物科學與工程學院，河北 石家莊 050000；2.河北省農林科學院 遺傳生理研究所/河北省植物轉基因中心，河北 石家莊 050051； 3.河北旺豐種業(yè)有限公司，河北 邢臺 054900)

小麥是我國主要的糧食作物之一，小麥產量的提高對于保障我國糧食安全具有重要的意義。低溫、干旱和病蟲害等逆境脅迫是造成小麥產量降低的重要因素[1]。其中，土壤鹽漬化作為一種影響農作物產量和質量的主要環(huán)境因素，對農業(yè)的發(fā)展也存在阻礙作用[2]。類鈣調磷酸酶B亞基蛋白(Calcineurin B-like protein，CBL)在植物非生物逆境應答和Ca2+信號介導過程中發(fā)揮重要作用[3]。CBL蛋白能感受細胞中Ca2+濃度并能與絲/蘇氨酸蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase，CIPK)互作對下游基因進行調控，從而對逆境脅迫進行應答反應[4-5]。李剛波等[6]研究發(fā)現(xiàn)，杜梨CBL4基因編碼蛋白由212個氨基酸殘基組成，且與擬南芥CBL4基因親緣關系最近，推測杜梨CBL4基因可能對Ca2+濃度的感受和傳遞具有調控作用，以此來進行逆境脅迫應答反應。擬南芥CBL4基因與水稻CBL4基因同樣存在較高的同源性，兩者在鹽響應信號途徑(Salt overly sensitive，SOS)中具有類似的信號系統(tǒng)，即主要在植物根部調控耐鹽性[7]。小麥抗干旱、低溫和高鹽脅迫等逆境的研究一直備受關注，尤其是CBL蛋白在其信號轉導過程中發(fā)揮的關鍵作用已成為研究的熱點、重點。

CBL4基因與其編碼蛋白的關系是通過三聯(lián)密碼子來建立的。在自然界存在61種密碼子，上述密碼子可編碼成20種氨基酸，這就會產生同義密碼子，即一種或多種密碼子編碼同一種氨基酸的現(xiàn)象[8]，并且每種密碼子的使用頻率存在差異[9-10]，出現(xiàn)頻率較高的密碼子為最優(yōu)密碼子，說明基因存在密碼子偏好性[11]。密碼子偏好性分析不僅可以為植物基因功能和進化差異研究提供理論依據(jù)[12]，而且基因表達水平的高低與其相對同義密碼子使用度(RSCU)密切相關[13]。因此，研究植物CBL4基因密碼子偏好性，對了解CBL4基因及其基因家族的進化規(guī)律、轉錄和翻譯的調控及提高基因表達水平均具有參考價值。但目前還未出現(xiàn)關于小麥CBL4基因密碼子偏好性的報道。為此，采用CodonW和Usage Codon軟件分析小麥CBL4基因密碼子偏好性，并將其與其他17種不同目植物CBL4基因密碼子偏好性進行比較，以期為小麥CBL4基因改良以提高對干旱、低溫和鹽脅迫等逆境的抗性提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

小麥及其他17種不同目植物CBL4基因核苷酸序列來源于NCBI的核苷酸數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

利用MEGA軟件分析CBL4基因堿基序列分布比例。使用Usage Codon在線軟件(http://www.geneinfinity.org/sms/sms_codonusage.html)計算18種植物CBL4基因的密碼子所占的比例和頻率。使用CodonW軟件計算18種植物CBL4基因的RSCU、ENc(有效密碼子數(shù))、GC(GC含量)、GC3s(密碼子第3位的GC含量)、CBI(密碼子偏愛指數(shù))和FOP(最優(yōu)密碼子使用頻率)、Gravy(蛋白質親水性)和Aromo(芳香族氨基酸比例)。通過SPSS軟件分析上述影響密碼子偏好性指標間的相關系數(shù)。利用Bioedit軟件比對不同植物CBL4基因編碼區(qū)核苷酸序列，再由MEGA軟件的最小進化法進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建，該系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性經1 000次重復的自舉檢驗法來檢驗。

2 結果與分析

2.1 小麥等18種植物CBL4基因堿基序列分析

如表1所示，小麥等18種不同目植物CBL4基因核苷酸序列長度不一致，小麥CBL4基因序列全長為657 bp，天門冬最短，全長324 bp，芝麻最長，全長678 bp，兩者相差354 bp，但兩者的堿基占總序列比例變化不大。小麥CBL4基因編碼區(qū)核苷酸序列中T所占比例最小，G和C所占比例較大，G+C所占比例達58.0%。馬鈴薯與小麥相反，主要由A和T組成，A+T所占比例達66.2%，高于其他17種植物，除小麥外的其他16種植物的堿基占比情況與馬鈴薯類似。小麥CBL4基因的ENc低于其他17種植物，而蘿卜的ENc最高；小麥的GC、GC3s、FOP和CBI均高于其他17種植物，而馬鈴薯的GC和GC3s均最低，香瓜的FOP和CBI均最低。小麥的G+C所占比例達58.0%，其中以第3位GC含量為主，提示GC含量對小麥CBL4基因密碼子偏好性具有重要的影響，而馬鈴薯與小麥形成鮮明的對比。

2.2 小麥CBL4基因密碼子偏好性分析

小麥CBL4基因共由219個密碼子組成，如表2所示，小麥CBL4基因偏好使用的密碼子依次是CUC、AGG、UAA、AUC、GUG、GCG、ACG、UGC和GGC，上述密碼子的RSCU≥2。其中，終止密碼子是UAA；而CUA、GUU、CUA、UCU、CCA、ACU、GCU、UGU、CGU、CGA、AGA、GGU、UAG和UGA這14個密碼子的RSCU為0，表明小麥CBL4基因在蛋白質合成過程中對密碼子的使用具有明顯的偏好性。

表1 CBL4基因編碼區(qū)堿基分布比例和部分偏性指標

表2 Usage Codon和CodonW程序分析小麥CBL4基因的密碼子偏好性

注：標下劃線處為大于1.5的RSCU，下同。

2.3 除小麥外的17種植物CBL4基因密碼子使用偏性指標及其影響因素

除小麥外的17種不同植物CBL4基因的RSCU如表3所示，多數(shù)植物對UUG、CUU、AUU、GUU、CCU、CCA、ACU、ACA、GCA、UAU、AGA、AGG密碼子的使用具有較強的偏好性。對于終止密碼子，不同植物的使用頻率不同。不同植物CBL4基因密碼子偏好性影響因素分析如表4所示，其中GC3s和GC均與CBI呈極顯著正相關，而Gravy和Aromo均與CBI呈負相關，但不顯著；ENc與GC3s、GC、Aromo均呈負相關，與Gravy呈正相關，但均不顯著。結果顯示,GC3s和GC是引起不同植物CBL4基因密碼子偏好性的主要因素，Gravy和Aromo對其密碼子使用有一定的影響，但不是主要因素。

表3 17種植物CBL4基因的RSCU

續(xù)表3 17種植物CBL4基因的RSCU

表4 偏性指標與影響因素的相關系數(shù)

注:**表示在0.01水平上極顯著相關。

2.4 小麥等18種植物CBL4基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

對18種不同植物CBL4基因的系統(tǒng)發(fā)育分析如圖1所示，小麥與向日葵之間的親緣關系最近，但兩者與其他16種植物的親緣關系最遠，與小麥密碼子使用特征差異最大的馬鈴薯與香瓜親緣關系最近，而香瓜的FOP和CBI與小麥相差最大，說明密碼子偏好性結果與聚類分析得出的親緣關系結果一致。

圖1 小麥等18種植物CBL4基因編碼區(qū)的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論與討論

目前，對植物CBL蛋白的研究已經從擬南芥這種模式生物發(fā)展到糧食作物、蔬菜和果樹等植物[14-19]。植物CBL基因在生物、非生物逆境應答和脫落酸(Abscisic acid，ABA)信號轉導中均發(fā)揮重要作用[20]。模式生物擬南芥CBL1、CBL2、CBL3、CBL4和CBL9基因均參與低鉀信號轉導途徑[21]。劉明毓等[22]推測,甜瓜CBL4基因參與鹽、冷、干旱等脅迫應答和ABA信號轉導途徑。余義和等[23]發(fā)現(xiàn)，葡萄CBL4基因啟動子活性在干旱、低溫和鹽脅迫處理后顯著提高，且其轉錄本在這些脅迫處理后也能快速響應。董鳳麗等[24]發(fā)現(xiàn)，甘菊CBL4基因可能也參與鹽、干旱等逆境脅迫的應答。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同植物CBL4基因核苷酸序列長度存在差異，小麥CBL4基因含有657個堿基，編碼219個氨基酸，其中CUC、AGG、UAA、AUC、GUG、GCG、ACG、UGC和GGC密碼子為其最優(yōu)密碼子，CUA、GUU、CUA、UCU、CCA、ACU、GCU、UGU、CGU、CGA、AGA、GGU、UAG和UGA密碼子的使用頻率為0，說明小麥是一種極其偏愛使用G/C結尾密碼子的植物，不偏愛使用A/U結尾的密碼子。小麥CBL4基因的終止密碼子為UAA(TAA)，有研究表明，使用TAA作為終止密碼子的生物多為低復雜度的真核生物(如酵母、非脊柱動物)，而使用TAG作為終止密碼子的生物也較少，使用TGA作為終止密碼子的生物主要是脊柱動物[25]。但植物CBL4基因所使用的終止密碼子不均是TAA，TAG和TGA終止密碼子的使用也較多，且無規(guī)律性，這可能與其堿基長度有關。

對小麥CBL4基因密碼子偏性指標進行分析發(fā)現(xiàn)，其ENc在18種植物中最低，但GC、GC3s、FOP和CBI均最高，與小麥不同的是，蘿卜的ENc最高，馬鈴薯的GC和GC3s最低，香瓜的FOP和CBI均最低，模式生物擬南芥的密碼子使用特征最接近蘿卜。有研究表明，擬南芥CBL4基因與玉米和番茄CBL4基因同源[26]，都存在類似的耐鹽性特征[27]。本研究的密碼子偏好性結果與聚類分析得出的親緣關系結果一致，即與小麥密碼子使用特征差異最大的馬鈴薯與香瓜親緣關系最近，表明密碼子偏好性結果有利于揭示植物CBL4基因的進化規(guī)律。小麥等植物CBL4基因密碼子使用偏好性的揭示，可以為選擇最優(yōu)密碼子來對抗干旱、低溫和鹽脅迫等逆境，以及人工合成基因序列提高目標蛋白表達水平等提供理論依據(jù)。