姜黃素對于老年癡呆癥模型大鼠外周血單個核細胞中組織蛋白酶B表達的影響

陳漢澤， 李進偉， 師 含， 滕偉禹， 田 力

溶酶體組織蛋白酶通過影響β淀粉樣蛋白(Amyloid-β,Aβ)的代謝從而參與了老年癡呆癥(Alzheimer’s disease,AD)的發(fā)展進程[1]，但姜黃素(curcumin)對于其中組織蛋白酶B (Cathepsin B,Cat B)在外周血單個核細胞中的表達與AD進展的關(guān)系之前未有文獻報道，本研究將Aβ1-42微量注射至大鼠右側(cè)海馬制作AD動物模型，經(jīng)姜黃素處理后檢測模型大鼠外周血單個核細胞中Cat B表達及活性變化，同時監(jiān)測其行為學改變；探討姜黃素對外周血免疫細胞中Cat B的作用，試圖尋找姜黃素對于AD治療作用的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 Aβ1-42(Sigma)、姜黃素(Sigma，純度>96%)。Morris水迷宮、腦立體定位儀(日本成茂公司)。DEPC、Trizol(Invitrogen)，Taq酶、dNTP、隨機引物(TaKaRa)，引物DH5α感受態(tài)菌、瓊脂糖、大鼠CathpesinB、GAPDH測序引物及Taqman探針(上海生工)，Aβ1-42、兔抗Aβ1-42多克隆抗體(Anaspec)，兔抗Cathpesin B多克隆抗體(Santa)，l640細胞培養(yǎng)基(invitrogen)，Cathepsin B Activity Assay Kit (BioVision)。其它常規(guī)試劑購自沈陽化學試劑采購供應站。定量PCR所用引物及探針序列(見表1)。

1.2 動物分組 健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～280 g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。大鼠適應性喂養(yǎng)1 w后，經(jīng)Morris水迷宮測試，4個象限測試中有2個象限超過2 min未找到安全平臺者視為記憶障礙被淘汰。剩余30只大鼠被隨機分為3組，每組10只，即假手術(shù)組、AD模型組和姜黃素干預組，其中5只用于外周血檢測，另外5只用于行為學檢測。

1.3 Aβ1-42致大鼠認知障礙模型的制備及給藥 用無菌生理鹽水將Aβ1-42稀釋成10 μg/μl，37 ℃下孵育1 w，使其變?yōu)榫奂瘧B(tài)Aβ。大鼠常規(guī)吸入麻醉后固定于立體定位儀上，顱頂部正中切開皮膚，根據(jù)George Paxinos等1998年版《大鼠腦立體定位圖譜》選擇右側(cè)海馬CA1區(qū)為注射靶區(qū)，于前囟向后3.0 mm，中線旁開2.2 mm處，鉆開顱骨，微量進樣器自腦表面垂直進針2.8 mm，將Aβ1-42緩慢注入(10 μl)，留針10 min以保證溶液充分彌散，然后緩慢撤針，假手術(shù)組注入等體積PBS。干預組于建模后給予300 mg/(kg·d)二甲基亞砜溶解的姜黃素，連續(xù)腹腔注射7 d，假手術(shù)組、AD模型組大鼠分別腹腔注射等量二甲基亞砜。各組術(shù)后均單籠飼養(yǎng)至大鼠完全清醒。術(shù)后第9天腹腔麻醉心臟采血5 ml并分離單個核細胞；另一半動物同時進行行為學測試。

1.4 實時定量PCR方法各組外周血單個核細胞中Cat B基因表 采用Taqman探針相對定量法，以GAPDH作為歸一化Cat B的持家基因。以構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA為標準品，以質(zhì)粒初始模板絕對量的對數(shù)作橫坐標、Ct值作縱坐標制作標準曲線。以“目的基因初始模板量/GAPDH初始模板量”比值代表每個標本目的基因的mRNA表達水平的相對量。每個標本重復檢測兩次，結(jié)果取均值。抽提對照組、AD模型組及姜黃素干預組(n=5)外周血單個核細胞的cDNA與質(zhì)粒標準品同時進行RT-qPCR，擴增Cat B和GAPDH，根據(jù)標準曲線計算各標本Cat B初始模板量與GAPDH初始模板量比值。

1.5 Morris水迷宮行為學測試 對照文獻方法[2]，于術(shù)后第9天，各組大鼠進行Morris水迷宮實驗測定學習記憶能力。

1.5.1 定位航行試驗 通過對訓練大鼠游泳尋找平臺，觀測其逃避潛伏期長短可檢測動物的學習能力。歷時5 d，2次/d，將大鼠面向池壁分別從2個入水點放入水中，記錄其在2 min內(nèi)尋找到平臺的時間(逃避潛伏期，escape latency)和游泳路徑。如果大鼠在2 min未找到平臺，潛伏期記為120 s，并由實驗者用木棒牽引其至平臺上，讓大鼠停留10 s，再放回籠中。

1.5.2 空間探索試驗 第6天撤除平臺，任選一個入水點放入水中，記錄2 min內(nèi)大鼠在池中的游泳軌跡和時間，分別計算在各象限所停留時間的百分比。

1.6 單個核細胞中Cat B活性測定 如前分別于術(shù)后第9天采集外周血并分離單個核細胞，采用活性試劑盒檢測其活性。操作過程按說明書，以相對熒光單位(RFU)表示蛋白酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對于大鼠外周血單個核細胞中Cat B表達的影響 定量PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組及AD模型組相比，姜黃素干預組外周血單個核細胞中Cat B mRNA表達水平均上調(diào)(P<0.05，見圖1)。

2.2 姜黃素對于大鼠外周血單個核細胞中Cat B活性的影響 蛋白活性分析結(jié)果顯示，與對照組及AD模型組相比，姜黃素干預組外周血單個核細胞的Cat B活性提高(P<0.01，見圖2)。

2.3 AD模型大鼠在Morris水迷宮中定向航行和空間探索試驗的表現(xiàn) 各組大鼠平均逃避潛伏期隨著游泳時間的延長而縮短，說明各組大鼠在5 d的游泳訓練期間學習尋找平臺的能力逐次提高。組間兩兩比較顯示:從第2天開始，AD模型組平均逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(P=0.014)；姜黃素干預組與AD模型組相比，平均逃避潛伏期明顯縮短(P=0.026，見表2)。

表1 定量PCR所用引物及探針序列

注：Taqman 探針5’端標記熒光報告基團FAM;3’端標記熒光淬滅基團TAMRA

表2 各組大鼠定向航行試驗平均逃避潛伏期

與對照組比較*P>0.05；與AD組比較#P<0.05

圖1 姜黃素對大鼠外周血單個核細胞中Cat B mRNA表達的影響

圖2 姜黃素對大鼠外周血單個核細胞Cat B 活性的影響

3 討 論

AD是引起老年人群癡呆的最主要原因,其病因、發(fā)病機制不清，尚無確切治療方法[3]。近年來研究結(jié)果顯示外周獲得性免疫反應與AD的發(fā)病及進展相關(guān)，Aβ1-42在腦內(nèi)沉積、引發(fā)神經(jīng)元凋亡是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，對于Aβ清除能力的下降是疾病發(fā)生發(fā)展的主要原因[4～6]。

Cat B是蛋白酶家族成員，在哺乳動物細胞溶酶體內(nèi)主要體現(xiàn)蛋白水解活性，能夠降解以內(nèi)吞或吞噬的方式進入到內(nèi)體/溶酶體的蛋白及多肽。研究顯示[7,8]：Cat B及Cat D活性失調(diào)可能導致年齡相關(guān)的病理變化，包括自噬體的聚集以及脂褐質(zhì)的形成均導致神經(jīng)功能失調(diào)等損傷。同時細胞內(nèi)未水解產(chǎn)物的不斷聚集也增加了細胞的抗氧化壓力。動物體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)[7]：Cat B有助于APP小鼠腦內(nèi)斑塊的清除；同時有研究證實Cat D在AD患者外周血單核細胞、淋巴細胞及皮膚成纖維瘤細胞中表達均下調(diào)[9～11]。但Cat B在大鼠腦內(nèi)注Aβ1-42后外周血單個核細胞中的表達情況及姜黃素對其表達的影響尚未見文獻報道。

姜黃素具有抗腫瘤、抗炎、抗HIV、抗菌、抗氧化等多種藥理作用，是從植物姜黃根莖中提取的一種酚類化合物，它可以通過抗氧化和抗炎等作用改善糖尿病等代謝性疾病、自身免疫疾病、動脈粥樣硬化等多種疾癥[12]。本實驗以腦內(nèi)注入Aβ1-42誘導制作的AD模型大鼠為研究對象，檢測姜黃素對大鼠外周血單個核細胞中Cat B表達的作用及對于認知功能的影響，探討姜黃素對AD的防治作用。

通過定量PCR方法顯示：大鼠腦內(nèi)注入Aβ1-42后外周血中Cat B表達無明顯變化，但姜黃素干預后AD模型組外周血單個核細胞中Cat B mRNA表達水平均明顯上調(diào)。為進一步探討Cat B表達上調(diào)的同時是否伴有酶活性的改變，我們?nèi)缜胺謩e采集對照組、AD模型組及姜黃素干預組外周血并分離單個核細胞，采用活性試劑盒檢測其活性，結(jié)果顯示：姜黃素干預后AD模型組單個核細胞中Cat B活性明顯提高。行為學分析結(jié)果也說明：和假手術(shù)組相比，Aβ1-42誘導的AD模型組大鼠學習記憶能力明顯減退，也說明AD動物模型造模成功。而姜黃素干預處理后，平均逃避潛伏期較AD模型組明顯縮短(P=0.026)。即姜黃素對改善認知功能障礙大鼠的學習及記憶能力的改善有一定促進作用。

動物體內(nèi)實驗表明[13,14]：姜黃素可以抑制AD小鼠腦內(nèi)Aβ的沉積，甚至使已經(jīng)沉積的神經(jīng)纖維斑塊體積變??；APP/PS1大鼠腦組織、血清中TNF-α和IL-6水平升高，姜黃素處理后血清TNF-α和IL-6等炎性細胞因子水平降低。這些研究結(jié)果均說明姜黃素具有抗炎及神經(jīng)保護作用。

目前AD的治療僅限于藥物對癥療法，未能有效延緩病程進展，同時因價格昂貴及副作用明顯等原因應用范圍有限。中藥以其多靶位、低毒性的特點在改善和延緩早期輕度認知損害等方面顯示出較好的療效。本實驗研究表明姜黃素在改善AD認知功能方面具有良好效果，為AD治療提供新思路。接下來將進一步深入研究姜黃素通過影響Cat B表達在改善AD大鼠行為學表現(xiàn)的作用機制。